circRNAs正在成为心脏发育和疾病强有力的调节因子，但其在心脏再生中的作用仍然未知。鉴于此，作者与他的团队探究了与超增强子(SEs)相关的circRNA-Nfix在小鼠心肌梗死后再生过程中的功能，并探究了其调节心脏重塑的分子机制，并于2019年4月5日，将该成果发表在了circulation杂志（IF=18.88）中。在本研究中，作者首先利用生物信息学分析RNA测序数据并结合SE目录，识别与SE相关的circRNAs，并利用qPCR和原位杂交技术检测发现发现circNfix在人类、大鼠和小鼠的成年心脏中过表达。然后通过在心肌梗死(MI)后心肌细胞(CM)中干扰或过表达circNfix，探究其对细胞增殖和心肌修复过程中的作用，并发现下调circNfix能够促进心肌梗死后CM增殖和血管生成，并抑制CM凋亡，减轻心功能障碍，改善预后效果。最后作者利用染色质免疫沉淀法(ChIP)和电泳迁移率转移法(EMSAs)方法测定转录因子Meis1与能够与circ-nfix的SE结合；利用RNA pull-down和荧光素酶报告基因分析方法研究circRNA与蛋白质或与miRNA的相互作用；发现下调circNfix能够增强Ybx1与Nedd4l (E3泛素连接酶)的相互作用，并诱导Ybx1发生泛素化降解，抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表达。此外, circNfix还作为ceRNA，吸附mir-214并促进Gsk3β表达和抑制β-catenin活性。即：SE调控的circNfix缺失通过抑制Ybx1泛素依赖降解，增加miR-214活性，促进心肌梗死后心脏再生修复和功能恢复，可能是改善心肌梗死预后的一个有前景的策略。
技术路线
（1）转录因子Meis1通过结合Nfix位点的SE驱动circNfix表达：H3k27ac、H3k4me1和H3k27me3在人心脏组织Nfix位点的ChIP-seq谱（云序生物提供该服务）（A）。H3k27ac、H3k4me1、H3k27me3、P300、DNA超敏(DHS)、Meis1及PhastCons在小鼠心脏组织Nfix位点的保守性评分，以及小鼠CMs中H3k27ac ChIP-seq（云序生物提供该服务）（B）。SE与circNfix启动子区looping事件的3C-qPCR分析（C）。四种成分增强子(E1、E2、E3、E4)构建的pgl3启动子报告载体荧光素酶检测（D）。Meis1沉默后P7 CMs中野生型E2和突变E2的荧光素酶活性（E）。circNfix-SE中孵育Meis1结合位点被DIG-ddUTP标记寡核苷酸探针后，P7 CMs中提取的核蛋白的EMSA结果（F）。ChIP-qPCR（云序生物提供该服务）检测显示Meis1结合位点在circNfix-SE中扩增（G）。QRT-PCR检测Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix和Nfix mRNA的表达水平（H）。RNA FISH 检测Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix的亚细胞定位（I）。EdU染色检测Meis1和circNfix干扰后对P7 CMs增殖的影响（J）。
（2）CircNfix与Ybx1结合并促进其降解：circNfix和对照组的蛋白质谱分析（A）。采用Ybx1、Nedd4l或阴性IgG抗体进行RIP实验（云序生物提供该服务）（B）。P0 CMs中过表达circNfix后Ybx1蛋白表达水平（C-D）。qRT-PCR检测P0 CMs中Ybx1 mRNA表达水平（E）。RNA FISH在P0 CMs中过表达和不表达circNfix时， circNfix和Ybx1的亚细胞共定位（F）。分馏实验表明，circNfix过表达促进了Ybx1在细胞质中的易位，增加了Ybx1在细胞质中的降解（G）。在circNfix和Ybx1干扰后，细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白B1的表达水平（H）。ChIP-qPCR（云序生物提供该服务）检测显示，cyclin A2和cyclin B1启动子中Ybx1结合位点扩增（I）。细胞裂解物用抗Ybx1抗体免疫沉淀，用泛素(Ub)特异性抗体、抗Ybx1抗体或抗nedd4l抗体免疫印迹分析进行WB分析。过表达circNfix的CMs中Ybx1蛋白表达水平（K-L）。
（3）circNfix与miR-214的相互作用：预测miR-214和miR-761能够与circNfix结合（A）。成年小鼠心脏中下调circNfix后，miR-214和miR-761的表达（B）。双荧光报告实验检测miR-214和circNfix能够直接结合（C）。RNA pull-down（云序生物提供该服务）实验检测circNfix能够拉下miR-214（D）。RNA FISH实验检测P0 CMs中，miR-124和circNfix能够共定位在胞质中（E）。RNA FISH实验检测P0 CMs中，miR-124和Gsk3β能够共定位在胞质中（F）。双荧光报告实验检测miR-214和Gsk3β 3’UTR直接结合（G）。WB检测干扰circNfix后Gsk3β蛋白的表达水平（H）。WB检测干扰或过表达miR-124后Gsk3β蛋白的表达水平（I）。WB检测干扰circNfix和miR-214后Gsk3β蛋白的表达水平（J）。CMs中，干扰circNfix后β-catenin的表达水平（K）。CMs中，干扰Meis1后Meis1和 Gsk3β的表达水平（L）。CMs中，干扰Meis1和circNfix后GSK3β的表达水平（M）。干扰circNfix, Ybx1, miR-214 和 Gsk3β后，P7 CMs进行pH3 和 Aurora B免疫染色（N）。
https://www.ahajournals.org/doi/pdf/10.1161/CIRCULATIONAHA.118.038361
环状RNA测序
RNA pull down
RIP测序
ChIP测序
m6A RNA全转录组甲基化测序
m6A RNA 环状RNA测序
m5C RNA全转录组甲基化测序
m5C RNA 环状RNA测序
m1A RNA全转录组甲基化测序
m1A RNA 环状RNA测序
超微量环状RNA甲基化测序
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