影响因子：17.521
发表时间：2022年11月16日
研究方法：m5C MeRIP-seq、RNA-seq、ChIP-seq
文章链接：RNA 5‐Methylcytosine Modification Regulates Vegetative Development Associated with H3K27 Trimethylation in Arabidopsis
技术路线
研究内容
1. 拟南芥EMF1正向调控无H3K27me3修饰光合作用和叶绿体相关基因的表达作者研究发现，功能缺失的emf1突变体和转基因LFY::asEMF1植株相较于野生型WT植株表现为淡绿色矮化植株。作者进一步研究了EMF1受损与WT植株的光合能力，发现LFY::asEMF1和emf1突变体叶绿体发育缺陷、淀粉积累、叶绿素含量降低、光合效率低。此外，分析WT和emf1幼苗RNA-seq数据可发现EMF1表达降低时，光合基因和叶绿体发育基因转录水平显著降低。RT-qPCR结果进一步验证了该结论，表明EMF1在促进光合作用和叶绿体基因的表达中起着关键作用。更重要的是，作者通过分析WT和emf1突变体中H3K27me3的全基因组ChIP-seq数据发现光合基因和叶绿体发育基因没有H3K27me3修饰，暗示EMF1并非通过先前研究已知的H3K27me3修饰调控其表达，而是存在新的的调控方式。
图1. EMF1正向调节未被H3K27me3甲基化的光合作用和叶绿体相关基因的表达
2. EMF1基因敲除导致mRNA m5C整体修饰水平升高
近期研究表明m5C参与了拟南芥的RNA代谢和根发育，以及水稻的光合作用和胁迫响应。
为了研究m5C是否参与了EMF1正向调控光合作用和叶绿体相关基因，作者通过dot blot，LC-MS/MS分析，发现emf1突变体和LFY::asEMF1植株相较于WT植株m5C整体修饰水平升高。接下来，作者通过m5C MeRIP-seq发现与WT植株相比，emf1突变体的m5C位点数量并没有显著变化，而富集程度显著增加。此外，作者通过RNA-seq与m5C MeRIP-seq联合分析发现，在emf1突变体中，大量m5C修饰基因相较WT植株表达水平下调，表明m5C修饰与基因转录水平负相关。MeRIP-qPCR及RT-qPCR结果验证了光合作用和叶绿体相关基因CAO、LHCB5和CHLI1在emf1突变体中m5C甲基化水平上调，表达水平下调。
图2. WT和emf1突变体中的m5C甲基化
3. EMF1通过H3K27me3修饰抑制淀粉合成基因
前文提到作者发现淀粉在emf1幼苗中过度积累，为了研究EMF1如何影响淀粉的积累，作者分析RNA-seq数据发现，在emf1突变体中，大多数淀粉合成基因（73%）表达上调。接下来，作者通过RT-qPCR验证了淀粉合成基因蔗糖合成酶1（SUS1）和SUS3在emf1植株中表达上调。此外，ChIP-seq结果显示，与WT植株相比，emf1突变体中SUS1和SUS3基因的H3K27me3富集显著减少，这通过ChIP-qPCR分析进一步证实，表明EMF1确实通过PcG机制抑制了淀粉生物合成基因的表达。
图3. EMF1功能的丧失导致幼苗中高度积累的淀粉缺陷
4. RNA m5C修饰与组蛋白H3K27me3修饰负相关
由于EMF1同时介导m5C和H3K27me3修饰，作者接下来探讨了m5C和H3K27me3修饰是否在表观基因组上相互作用。首先，作者分析了拟南芥全基因组甲基化图谱，发现在emf1突变体中，与WT植株相比，H3K27me3修饰在所有染色体上的富集量均减少，而m5C在所有染色体上的富集量均增加。值得注意的是，m5C甲基化峰更多地富集在H3K27me3稀疏的染色质区域，反之亦然，体现出一种互补分布模式。作者进而研究发现在emf1突变体中，m5C修饰的光合基因表达下调，而H3K27me3修饰的花基因和种子基因表达上调，表明EMF1介导的RNA m5C和H3K27me3修饰分别调控不同的靶基因集。此外，m5C甲基转移酶TRM4A和TRM4B在emf1突变体中表达水平显著升高。ChIP-qPCR分析TRM4B基因，结果显示TRM4B基因无H3K27me3修饰而有H3K4me3修饰，且emf1突变体中TRM4B的表达水平升高确实与其位点上更丰富的H3K4me3修饰相关。这些结果表明，EMF1通过H3K4me3调控TRM4B的转录，而不依赖于PcG介导的H3K27me3机制，并提高m5C甲基转移酶的表达，从而促进emf1突变体中m5C的修饰。
图4. RNA m5C修饰与组蛋白H3K27me3修饰负相关
小 结
本研究通过m5C MeRIP-seq、RNA-seq、ChIP-seq联合分析，发现EMF1除了通过PcG机制介导组蛋白H3K27me3修饰发挥抑制作用外，还通过调节拟南芥中TRM4B活性，介导RNA m5C修饰正向调控光合作用和叶绿体相关基因，进而促进营养发育。
云序生物m5C甲基化研究五大模块
01 m5C RNA甲基化测序
m5C RNA甲基化测序（m5C-seq）
对m5C RNA甲基化，目前最流行的检测手段为m5C-Seq技术，适用于m5C RNA甲基化谱研究，快速筛选m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m5C测序：
- m5C 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
- m5C LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
- m5C Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
- m5C mRNA测序
LC-MS/MS检测整体RNA甲基化水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
03 m5C RNA甲基化上游酶的筛选
m5C RNA甲基化相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m5C RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m5C RNA甲基化靶基因验证
meRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05 机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。
云序生物服务优势
优势一：云序累计支持客户发表 100 + 篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子 960 +
优势二：累计完成数千例 RNA甲基化测序样本，覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：可检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：提供m5C一站式服务：m5C整体水平检测、m5C-seq、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五：超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：提供多种 RNA 修饰测序服务，包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
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