N6-甲基腺苷（m6A）是最普遍的mRNA内部修饰，通过甲基化酶（writer）、去甲基化化酶（eraser）和阅读蛋白（reader）的合作参与细胞过程。m6A对mRNA下游调控如翻译、输出和稳定性的影响主要由识别修饰靶点的reader决定。云序客户南京医科大学陈峰课题组在American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 杂志（IF=21.405）上发表了关于m6A reader蛋白在肺动脉高压（PAH）发病机制中作用的文章，展示了人类PAH患者和实验性PH模型中m6A水平和YTHDF1 reader蛋白表达，YTHDF1 reader蛋白的机制作用，并表明针对YTHDF1或MAGED1的策略可能是治疗PH的有效疗法。云序生物有幸参与本项目当中的m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq以及生信分析。
下面我们就为大家解析这篇研究reader蛋白的文章思路和成果。

发表期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine
发表日期：2021年5月1日
影响因子：21.405
研究方法：比色法检测m6A整体水平、m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq、MeRIP-qPCR
文章链接：YTHDF1 Regulates Pulmonary Hypertension through Translational Control of MAGED1

技术路线

研究内容

一、m6A修饰水平在人类PAH患者和实验性PH模型中上调
首先，作者用比色法检测了PAH患者（n=7）和Su/Hx诱导PAH小鼠的肺组织（n=8）、MCT诱导大鼠的肺动脉组织（n=8），发现与对应的健康组织相比整体m6A甲基化水平上调。同时，也发现在PAH组织中，m6A reader蛋白YTHDF1的表达上调。并且，YTHDF1蛋白表达量和RNA整体m6A水平都随着缺氧时间一起增加。这些结果提示了YTHDF1与m6A修饰可能参与了PH病理生理过程。

二、YTHDF1基因敲除改善PH
为验证YTHDF1对PH病理生理过程的影响，一方面作者在小鼠中敲降YTHDF1进行Su/Hx诱导PH实验，通过血液动力学、肺动脉血管壁厚度和肌化、肺动脉平滑肌细胞增殖等指标，发现敲降YTHDF1可改善小鼠PH和PVR发展。另一方面，目前已知PASMC细胞表型转化在PH的发病机制中起重要作用，作者在 HPASMC中敲降YTHDF1，发现可改善细胞增殖、表型转换和凋亡抵抗。

三、YTHDF1蛋白表达增加与蛋白降解改变有关
有趣的是，作者发现虽然YTHDF1蛋白表达量在PH患者和动物模型中上调，但是YTHDF1的mRNA却不变甚至轻微下调。于是作者通过转录抑制实验和蛋白合成抑制试验在HPASMCs中验证到，缺氧诱导PH过程中YTHDF1转录本稳定性不变而蛋

四、MAGED1是Su/Hx处理小鼠m6A修饰和YTHDF1的靶点
为了寻找YTHDF1作用的靶基因，作者对Su/Hx诱发PH的小鼠和对照小鼠进行了m6A MeRIP-seq、RNA-seq和RIP-seq。m6A修饰谱展现了m6A位点多分布在终止密码子，甲基化峰保守序列分析显示RRACH序列显著富集。对三组学差异基因取交集后进行了GO和KEGG分析。

图4-1.png

图片处理组m6A修饰水平上调且与YTHDF1结合的基因中，MAGED1基因的功能与细胞凋亡、分化和增殖相关，筛选其为潜在靶基因。与对照组相比，在Su/Hx处理小鼠中，作者通过MeRIP-qPCR验证了MAGED1的m6A修饰水平升高，通过RIP实验验证到结合YTHDF1的MAGED1蛋白更加富集。另外，同样进行Su/Hx处理，在敲降YTHDF1的小鼠MAGED1蛋白表达量低于野生型。这些结果表明，Su/Hx诱导PH的模型小鼠中，MAGED1蛋白经由m6A修饰受YTHDF1调控。

五、YTHDF1识别并促进m6A修饰的MAGED1 mRNA的翻译
接下来作者探究了YTHDF1调控MAGED1的机制。作者观察到在患者和小鼠模型中，MAGED1蛋白水平随着促PH因子的作用而升高，但MAGED1基因mRNA却没有显著差异。于是针对YTHDF1作者1) 通过RIP-qPCR发现缺氧诱导PH的小鼠中YTHDF1结合的MAGED1 mRNA更加富集; 2)通过敲降和过表达YTHDF1发现影响MAGED1蛋白表达而不是mRNA水平；3）通过CHX处理区分验证了HPASMCs中过表达YTHDF1不改变MAGED1蛋白降解速率，说明YTHDF1是通过影响翻译效率实现提高MAGED1蛋白表达。除此之外，作者还在过表达YTHDF1的HPASMCs中敲降了甲基化酶METTL3，发现会减弱YTHDF1促进MAGED1蛋白表达的效果。这些实验结果证明，YTHDF1通过促进带有m6A修饰的靶基因MAGED1的蛋白翻译效率从而增强其蛋白表达。

六、靶基因MAGED1对PH的促进作用
最后作者研究了靶基因MAGED1对PH病理生理过程的影响。通过动物实验和细胞实验，验证了敲降MAGED1对PH小鼠血管重塑和心功能损害具有保护作用，进一步又验证了MAGED1通过上调PCNA促进缺氧状态下PASMC的细胞增殖、迁移和存活。

总结

这篇文章首先通过比色法检测了PH中整体m6A修饰水平上调，m6A reader蛋白YTHDF1表达上调，揭示了m6A修饰在PH病理生理学中的潜在作用。然后通过云序生物提供的m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq寻找m6A修饰和受YTHDF1调控的靶基因MAGED1。在疾病患者、模型小鼠、PASMC细胞中，一方面验证了YTHDF1 reader蛋白在疾病中表达提高，另一方面从结合mRNA、调控mRNA和蛋白表达水平等方面，验证了YTHDF1通过m6A修饰促进靶基因MAGED1的蛋白表达。最后验证了靶基因MAGED1对PH的促进作用。本研究首次将m6A水平和YTHDF1丰度的增加与PH的发展联系起来，并表明针对YTHDF1或MAGED1的干预可能是治疗PH的有效方法。

云序生物m6A修饰研究五大模块

01 m6ARNA修饰测序
m6A RNA修饰测序（m6A-MeRIP-seq）
对m6A RNA甲基化，目前最流行的检测手段为m6A-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：

m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
m6A LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
m6A Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
m6A mRNA测序
m6A miRNA测序

02 检测整体m6ARNA修饰水平

LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平

03 m6A RNA修饰上游酶的筛选

m6A RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

云序生物服务优势

优势一：发表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化测序服务平台。云序已累计支持客户发表57篇高水平RNA修饰文章，合计影响因子480分+，是国内支持发文最多、累计影响因子最高的公司。
优势二：至今完成4000+例 m6A测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：独家提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：国内最全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。

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