文章导读
众所周知，运动可以降低心血管疾病的发生概率。目前已有的研究报道主要集中在肌肉因子方面，因为它具有旁分泌和内分泌作用，能够协调运动的多系统效应。然而，运动对心脏保护作用的潜在机制目前尚未可知。第四军医大学高峰、王立锋科研团队的最新研究成果表明，长期运动衍生的循环外泌体能够传递心脏保护信号，并鉴定出外泌体miR-342-5p是一种新的心脏保护性运动因子，能够对抗大鼠心肌缺血和再灌注（MI/R）引起的损伤。
众所周知，运动可以降低心血管疾病的发生概率。目前已有的研究报道主要集中在肌肉因子方面，因为它具有旁分泌和内分泌作用，能够协调运动的多系统效应。然而，运动对心脏保护作用的潜在机制目前尚未可知。第四军医大学高峰、王立锋科研团队的最新研究成果表明，长期运动衍生的循环外泌体能够传递心脏保护信号，并鉴定出外泌体miR-342-5p是一种新的心脏保护性运动因子，能够对抗大鼠心肌缺血和再灌注（MI/R）引起的损伤。
发表期刊：Circulation Research
影响因子：15.211
实验方法：miRNA测序
实验材料：长期运动的人和大鼠的血浆（实验组），不运动的人和大鼠的血浆（对照组）
影响因子：15.211
实验方法：miRNA测序
实验材料：长期运动的人和大鼠的血浆（实验组），不运动的人和大鼠的血浆（对照组）
文章内容
1.运动对血浆外泌体数量无影响
本篇文章作者首先收集了运动和久坐的大鼠的血浆，从中分离出外泌体，运动大鼠血浆中外泌体为实验组(exe-exo)，久坐大鼠血浆中外泌体为对照组(sed-exo)（图1A），对外泌体进行镜检后（图1B），又检测了两组的外泌体蛋白，结果显示两组间外泌体的量并没有显著差异（图1C），且NTA分析也显示，两组的粒径分布和血浆浓度没有显著性差异（图1D和E）。然后作者用pkh26标记的外泌体和心肌细胞共培养，观察到外泌体在孵育6小时后被心肌细胞内化(图1F)。
图1. 运动和久坐大鼠的外泌体数量无差异；外泌体能被心肌细胞内化
那么问题来了，上述两种情况在人体中是否也存在呢？
于是作者对人做了相同的检测。运动员血浆外泌体为实验组(Row-exo)和普通人的血浆外泌体为对照组(Con-exo)，结果与大鼠一致(图2K和L)。此外，作者还发现将运动员的外泌体和人的心肌细胞共培养后，可以降低细胞凋亡(图2M)，同时释放血清乳酸脱氢酶LDH(图2O)，并能增加心肌细胞活力(图2N)。
图2. 运动员和普通人的外泌体数量也无差异；外泌体也能被心肌细胞内化
2.运动分泌外泌体（exe-exo）对MI/R损伤有心肌保护作用
首先作者对两组大鼠进行心肌缺血30 分钟，再灌注24小时的损伤破坏，发现与久坐对照组(sed)相比，运动组(exe)大鼠心肌梗死面积减少，LDH降低，表明运动对MI/R损伤有明显的心肌保护作用。
首先作者对两组大鼠进行心肌缺血30 分钟，再灌注24小时的损伤破坏，发现与久坐对照组(sed)相比，运动组(exe)大鼠心肌梗死面积减少，LDH降低，表明运动对MI/R损伤有明显的心肌保护作用。
为研究运动分泌的外泌体对心肌保护的作用，作者从两组大鼠的等体积血浆中分离出外泌体，并在MI/R损伤前的48小时，将携带pkh26标记的外泌体注射进正常大鼠心肌。接着对大鼠进行MI/R损伤，24小时后发现，与注射sed-exo的大鼠相比，注射exe-exo的大鼠心脏梗死面积显著减小(图3A)，同时伴有LDH降低。此外，作者还发现注射exe-exo的大鼠心脏功能得到改善，如MI/R后保留射血分数和分数缩短4周（图3F-H）。综上，exe-exo对MI/R损伤具有心肌保护作用。
图3. Exe-exo能减少MI/R损伤导致的心肌梗死面积，改善心脏功能
3.miR-342-5p是exe-exo中诱导心脏保护的关键成分
为了探讨miRNA在外泌体诱导的心脏保护中发挥作用的可能性，作者分别对两组大鼠外泌体中的miRNA进行了高通量测序（云序可以提供此服务）。共检测到14个差异表达的miRNAs(图4A)，经q-PCR分析进一步验证后，确定12个差异表达的miRNAs，其中11个表达上调(图4B)。接着作者用缺氧/复氧（H/R）模型研究这11种上调的miRNAs如何影响心肌细胞的功能。发现miR-342-5p能显著降低H/R作用下心肌细胞的凋亡，降低LDH的释放，提高细胞活力(图4C-E)。
为了探讨miRNA在外泌体诱导的心脏保护中发挥作用的可能性，作者分别对两组大鼠外泌体中的miRNA进行了高通量测序（云序可以提供此服务）。共检测到14个差异表达的miRNAs(图4A)，经q-PCR分析进一步验证后，确定12个差异表达的miRNAs，其中11个表达上调(图4B)。接着作者用缺氧/复氧（H/R）模型研究这11种上调的miRNAs如何影响心肌细胞的功能。发现miR-342-5p能显著降低H/R作用下心肌细胞的凋亡，降低LDH的释放，提高细胞活力(图4C-E)。
为了更好地了解外泌体miR-342-5p的功能，作者又检测了血浆外泌体处理的心肌细胞和心脏中miR-342-5p及其前体的水平。心肌细胞经exe-exo孵育和心脏注射48小时后，其中的miR-342-5p水平显著升高(图4G)，而前体m iR-342-5p水平无明显变化，表明exe-exo将miR-342-5p传递给心肌细胞或心脏。此外，抑制miR-342-5p可以明显减弱运动型血浆外泌体对心脏的保护作用(图4H-J)。这些结果表明miR-342-5p在外泌体诱导的心脏保护中起着关键的作用。
那长期运动是否会导致人体外泌体中miR-342-5p的差异表达呢？
于是作者检测了运动员训练前后血浆外泌体中的miR-342-5p含量，发现训练后它的表达量比未受训的时候提高了1.8倍(图4F)。
图4. miR-342-5p在exe-exo提供的心脏保护中起关键作用
4.miR-342-5p通过靶向结合心肌细胞中的Caspase 9和Jnk2发挥抗凋亡作用
为进一步研究miR-342-5p的作用机制，作者预测了miR-342-5p的靶基因，发现Caspase3、Caspase9和Jnk2能参与MI/R损伤和凋亡途径(图5A)。接着作者又发现增加miR-342-5p后，可以显著降低Caspase9和Jnk2的蛋白水平，反之亦然，但没有观察到Caspase3基因表达的显著改变(图5B)。接着作者用荧光素酶进一步研究了Caspase9和Jnk2两个基因与miR-342-5p的结合位点(图5C)。此外，exe-exo孵育可以显著抑制H/R诱导的心肌细胞裂解-Caspase3、裂解-Caspase9和磷酸(P)-Jnk2的表达(图5D)。综上，这些数据表明miR-342-5p通过靶向结合Caspase9和Jnk2，在心肌细胞中发挥抗凋亡作用。
为进一步研究miR-342-5p的作用机制，作者预测了miR-342-5p的靶基因，发现Caspase3、Caspase9和Jnk2能参与MI/R损伤和凋亡途径(图5A)。接着作者又发现增加miR-342-5p后，可以显著降低Caspase9和Jnk2的蛋白水平，反之亦然，但没有观察到Caspase3基因表达的显著改变(图5B)。接着作者用荧光素酶进一步研究了Caspase9和Jnk2两个基因与miR-342-5p的结合位点(图5C)。此外，exe-exo孵育可以显著抑制H/R诱导的心肌细胞裂解-Caspase3、裂解-Caspase9和磷酸(P)-Jnk2的表达(图5D)。综上，这些数据表明miR-342-5p通过靶向结合Caspase9和Jnk2，在心肌细胞中发挥抗凋亡作用。
图5. miR-342-5p通过结合心肌细胞中的Caspase 9和Jnk2发挥抗凋亡作用
5.miR-342-5p通过靶向结合Ppm1f增强心肌细胞中AKT的磷酸化
生存信号AKT和ERK 1/2已被证实为心脏保护的关键分子。miR-342-5p可以上调心肌细胞中AKT的磷酸化，而ERK 1/2的磷酸化水平没有明显变化(图6A)；在H/R心肌细胞中观察到类似的现象(图6B-D)。这些结果表明，miR-342-5p能激活心肌细胞的生存信号AKT。有趣的是，作者发现Ppm1f是miR-342-5p的潜在靶点，这是生信分析预测的唯一磷酸酶（图6E）。如图6F所示，miR-342-5p可以减少Ppm1f蛋白水平，反之亦然。荧光素酶报告分析进一步证实miR-342-5p可以直接结合Ppm1f的3'UTR区(图6G)。值得注意的是，下调Ppm1f蛋白表达不仅显著提高AKT的磷酸化水平(图6H-I)，还可以降低H/R诱导的心肌细胞凋亡(图6J)，这暗示AKT磷酸化水平升高可能在心肌保护中发挥作用。
生存信号AKT和ERK 1/2已被证实为心脏保护的关键分子。miR-342-5p可以上调心肌细胞中AKT的磷酸化，而ERK 1/2的磷酸化水平没有明显变化(图6A)；在H/R心肌细胞中观察到类似的现象(图6B-D)。这些结果表明，miR-342-5p能激活心肌细胞的生存信号AKT。有趣的是，作者发现Ppm1f是miR-342-5p的潜在靶点，这是生信分析预测的唯一磷酸酶（图6E）。如图6F所示，miR-342-5p可以减少Ppm1f蛋白水平，反之亦然。荧光素酶报告分析进一步证实miR-342-5p可以直接结合Ppm1f的3'UTR区(图6G)。值得注意的是，下调Ppm1f蛋白表达不仅显著提高AKT的磷酸化水平(图6H-I)，还可以降低H/R诱导的心肌细胞凋亡(图6J)，这暗示AKT磷酸化水平升高可能在心肌保护中发挥作用。
图6. miR-342-5p靶向结合Ppm1f，增强心肌细胞中AKT的磷酸化
6.内皮细胞是运动分泌外泌体中miR-342-5p的主要来源
为探讨长期运动引起的大鼠循环外体miR-342-5p增加的原因，作者检测了大鼠心脏、骨骼肌、主动脉、肝脏、脂肪组织、肾脏、脾脏和血浆中成熟miR-342-5p及其前体的表达，发现成熟miR-342-5p在多个组织中均有表达(图7A)。而运动后，这些组织中的成熟miR-342-5p和前体miR-342-5p的量均显著增加，出乎意料的是，它们的增加主要发生在主动脉而不是骨骼肌或心肌细胞中(图7B-C)。进一步研究表明，去除主动脉内皮细胞后，成熟miR-342-5p和前体miR-342-5p的量可明显降低，暗示内皮细胞是主动脉miR-342-5p的主要来源(图7D)。接着，作者从运动大鼠和久坐大鼠中分离出主动脉内皮细胞，发现长期运动显著增加了内皮细胞中成熟的miR-342-5p和前体miR-342-5p(图7E)。此外，电镜发现内皮细胞质中存在典型的多囊体(MVBS)，MVBS与质膜融合，释放外泌体进入循环(图7F)。这些结果提示血管内皮细胞是运动引起的外泌体中miR-342-5p的重要来源。
为探讨长期运动引起的大鼠循环外体miR-342-5p增加的原因，作者检测了大鼠心脏、骨骼肌、主动脉、肝脏、脂肪组织、肾脏、脾脏和血浆中成熟miR-342-5p及其前体的表达，发现成熟miR-342-5p在多个组织中均有表达(图7A)。而运动后，这些组织中的成熟miR-342-5p和前体miR-342-5p的量均显著增加，出乎意料的是，它们的增加主要发生在主动脉而不是骨骼肌或心肌细胞中(图7B-C)。进一步研究表明，去除主动脉内皮细胞后，成熟miR-342-5p和前体miR-342-5p的量可明显降低，暗示内皮细胞是主动脉miR-342-5p的主要来源(图7D)。接着，作者从运动大鼠和久坐大鼠中分离出主动脉内皮细胞，发现长期运动显著增加了内皮细胞中成熟的miR-342-5p和前体miR-342-5p(图7E)。此外，电镜发现内皮细胞质中存在典型的多囊体(MVBS)，MVBS与质膜融合，释放外泌体进入循环(图7F)。这些结果提示血管内皮细胞是运动引起的外泌体中miR-342-5p的重要来源。
接下来，作者研究了内皮细胞释放的外泌体是否能被心肌细胞所吸收。作者用cy3标记内皮细胞分泌的外泌体，并将其添加到人的心肌细胞中(图7G)。共聚焦成像证实了cy3标记的miRNAs可以从内皮细胞向心肌细胞转运(图7H)。将cy3标记的外泌体与心肌细胞共同孵育，结果表明，受体心肌细胞中miR-342-5p增加(图7I)。更重要的是，受体心肌细胞在H/R损伤后凋亡减少(图7J)。综上，这些结果表明内皮细胞释放的mi-342-5p不仅可以被心肌细胞所吸收，而且可以保护心肌细胞免受H/R损伤。
7.层切应力(LSS)刺激可以上调内皮细胞miR-342-5p的表达
血流诱导的LSS是一种与运动有关的生理刺激物，被认为是运动诱导内皮细胞适应的中枢信号机制。为了研究LSS对miR-342-5p产生的影响，作者将人脐静脉内皮细胞，分别置于静止条件和LSS条件中培养。发现LSS不仅增加了细胞中成熟的miR-342-5p和pre-miR-342-5p(图7K)，而且增加了外泌体miR-342-5p的分泌(图7L)。这表明运动诱导的LSS可以直接刺激内皮细胞产生和释放miR-342-5p。
血流诱导的LSS是一种与运动有关的生理刺激物，被认为是运动诱导内皮细胞适应的中枢信号机制。为了研究LSS对miR-342-5p产生的影响，作者将人脐静脉内皮细胞，分别置于静止条件和LSS条件中培养。发现LSS不仅增加了细胞中成熟的miR-342-5p和pre-miR-342-5p(图7K)，而且增加了外泌体miR-342-5p的分泌(图7L)。这表明运动诱导的LSS可以直接刺激内皮细胞产生和释放miR-342-5p。
图7. 内皮细胞是运动分泌外泌体中miR-342-5p的主要来源；
miR-342-5p可以被心肌细胞吸收，并保护心肌细胞免受H/R损伤；
LSS可以直接刺激内皮细胞产生和释放miR-342-5p
miR-342-5p可以被心肌细胞吸收，并保护心肌细胞免受H/R损伤；
LSS可以直接刺激内皮细胞产生和释放miR-342-5p
8.miR-342-5p在体内长期运动诱导的心脏保护中起着不可或缺的作用
为了探讨体内miR-342-5p在运动诱导的心脏保护中的作用，作者使用带有特定序列的病毒(AAV9)来抑制大鼠心脏中的miR-342-5p。游泳训练前一周，在大鼠心肌内注射AAV-anti-miR-342-5p或AAV阴性对照(图8A)，在训练24小时后检测到转染AAV9。如图8所示，运动训练可以增加心脏中的miR-342-5p(图8B)，同时减少Caspase 9、Jnk 2和Ppm1f表达，增强AKT的磷酸化；而降低miR-342-5p可减轻这些变化(图8C)。重要的是，运动后，MI/R损伤导致的大鼠心肌梗死面积(图8D-E)和心肌细胞凋亡(图8F-G)明显减少，降低miR-342-5p后，这种情况显著减弱(图8D-G)。在MI/R损伤前48小时注射miR-342-5p，可以显著升高大鼠心脏的miR-342-5p表达水平(图8H)，缩小心肌梗死范围(图8I)。综上，这些体内数据表明，在长期运动诱导的心脏保护中，miR-342-5p对抵抗MI/R损伤起着至关重要的作用。
为了探讨体内miR-342-5p在运动诱导的心脏保护中的作用，作者使用带有特定序列的病毒(AAV9)来抑制大鼠心脏中的miR-342-5p。游泳训练前一周，在大鼠心肌内注射AAV-anti-miR-342-5p或AAV阴性对照(图8A)，在训练24小时后检测到转染AAV9。如图8所示，运动训练可以增加心脏中的miR-342-5p(图8B)，同时减少Caspase 9、Jnk 2和Ppm1f表达，增强AKT的磷酸化；而降低miR-342-5p可减轻这些变化(图8C)。重要的是，运动后，MI/R损伤导致的大鼠心肌梗死面积(图8D-E)和心肌细胞凋亡(图8F-G)明显减少，降低miR-342-5p后，这种情况显著减弱(图8D-G)。在MI/R损伤前48小时注射miR-342-5p，可以显著升高大鼠心脏的miR-342-5p表达水平(图8H)，缩小心肌梗死范围(图8I)。综上，这些体内数据表明，在长期运动诱导的心脏保护中，miR-342-5p对抵抗MI/R损伤起着至关重要的作用。
图8. 在运动诱导的心脏保护中，miR-342-5p对抵抗MI/R损伤起重要作用
总结：
长期运动衍生的循环外泌体，虽然其血浆水平没有显著变化，但对MI/R损伤提供了深远和持续的心脏保护。作者发现外体miR-342-5p是抑制凋亡信号(Caspase9和Jnk2)，增强心脏存活信号(P-Akt)的关键心脏保护分子。血管内皮细胞可能是外泌体miR-342-5p的主要来源，表明在运动提供的心脏保护中，血管与心脏之间的相互干扰。这些发现揭示了运动给予心肌保护可以作为一种新型的心肌保护作用机制，突出了miR-342-5p在缺血性心脏病预防和康复中的治疗潜力。
长期运动衍生的循环外泌体，虽然其血浆水平没有显著变化，但对MI/R损伤提供了深远和持续的心脏保护。作者发现外体miR-342-5p是抑制凋亡信号(Caspase9和Jnk2)，增强心脏存活信号(P-Akt)的关键心脏保护分子。血管内皮细胞可能是外泌体miR-342-5p的主要来源，表明在运动提供的心脏保护中，血管与心脏之间的相互干扰。这些发现揭示了运动给予心肌保护可以作为一种新型的心肌保护作用机制，突出了miR-342-5p在缺血性心脏病预防和康复中的治疗潜力。
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https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/CIRCRESAHA.118.314635
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