类器官是能够在体外三维培养，并表现出相应器官生物学特征的“最小系统”。虽然对于类器官的研究日趋成熟，但大家总会有这样那样的小困惑：为什么要用上皮细胞培养？为什么培养基的成分这么复杂？

今天小编整理了一些关于类器官构建原理方面的问题，希望能够对各位小伙伴有所帮助。

Q1: 类器官培养对于起始细胞的来源有要求吗？

A1: 目前培养的类器官主要来源于上皮细胞，对于非上皮细胞来源的类器官培养方式还需要进一步研究。

Q2: 类器官按照起始细胞的类型，分为几种呢？

A2: 常见的类器官根据起始细胞的类型，可以分为两种：

（1）肿瘤组织来源的肿瘤类器官；

（2）干细胞来源的类器官，包括：多能性干细胞 (PSC) /成体干细胞 (ASC)以及诱导多能干细胞(iPSC)。

Q3: 类器官是由单一种类细胞组成的吗？

A3: 类器官并不是单一细胞组成的结构，而是由具有干细胞性质的起始细胞进行分裂和分化，并将多种类型的细胞自组装的结构，自组装后的形态和功能与体内相应器官相似。

Q4：在没有新鲜组织的情况下，可以用冻存组织提取的原代细胞进行3D培养吗？

A4：可以的。已有学者验证过，将人结肠癌、甲状腺癌、肺癌、肾癌和肝癌的手术组织切碎后，以梯度降温的方式进行冷冻，最终在液氮中保存15-18个月后进行复苏和原代细胞提取，分别对细胞进行2D和3D培养，证实了冻存对于细胞活力和生长速度均无显著影响^【1】。

当然，由于组织来源不同、冻存条件不同，还需要大家根据实际情况进行验证，新鲜组织提取的细胞依然是3D培养的最佳选择。

Q5：类器官可以像细胞一样进行冻存和复苏吗？

A5：类器官可以冻存，通常会在传代2-3次之后选择冻存。为了达到最佳的效果，可以选择类器官成熟（传代7-10次）后再进行冻存。

Q6：类器官的尺寸需要进行控制吗？

A6：是的，主要的原因是类器官内部缺乏循环系统。

当类器官的尺寸较大时，靠近中心的细胞难以和外界进行氧气和营养成分的交换。因此这个结构尺寸越大，死亡的细胞就越多（如图1）^【2】。我们在培养的过程中，需要控制类器官的大小在4-5mm以内。未来的类器官技术可以与血管类器官结合在一起，建立一个功能性的封闭循环系统，用以培养出更大尺寸的类器官。

图1. TUNEL染色表明较大尺寸的类器官中心有大量细胞死亡（绿色），比例尺为100μm^【2】

Q7：类器官传代的标准是什么？

A7：类器官的传代通常是根据培养的时间判断。一般在7-14天时进行第一次传代，后续则每7-10天传代一次^【3】。

Q8：类器官可以进行多少次传代？

A8：大部分类器官可以在体外连续传代10次（>6个月），甚至有些类器官可以连续传代20次（>12个月）并且维持原有的生长速度^【4】。

Q9: 鉴定类器官的方法有哪些？

A9: 初步可以通过显微镜和H&E染色观察形态；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫荧光、流式细胞术检测该类器官是否表达相应的biomarker；基因测序可以鉴定所培养的类器官是否有某些特征丢失；对于部分类器官，还可以检测其是否具有功能，例如：已有研究检测出胃类器官可以分泌胃酸，心脏类器官可以自主跳动。

Q10: 类器官是如何按照我们的意愿进行定向分化的？

A10: 在进行类器官培养前，我们需要了解该器官在体内的发育过程，及早期发育相关的信号通路。

以胃类器官培养为例：胃由前后肠发育而来，早期发育需要由多种信号通路共同调控。那么在体外我们需要通过添加细胞因子的方式，指导激活/抑制相应的信号通路，来达到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化为内胚层，Wnt3a、FGF-4和Noggin指导细胞向向前肠分化^【5】。

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参考文献

【1】He, A. et al. (2020). Cryopreservation of viable human tissues: Renewable resource for viable tissue, cell lines, and organoid development. Biopreservation and Biobanking, 18(3), 222-227.

【2】Lancaster, M. A. et al. (2013). Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature, 501(7467), 373-379.

【3】Sheridan, M. A. et al. (2020). Establishment and differentiation of long-term trophoblast organoid cultures from the human placenta. Nature Protocols, 15(10), 3441-3463.

【4】Beshiri, M. L. et al.(2018). A PDX/organoid biobank of advanced prostate cancers captures genomic and phenotypic heterogeneity for disease modeling and therapeutic screening. Clinical Cancer Research, 24(17), 4332-4345.

【5】McCracken, K. W. et al. (2014). Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature, 516(7531), 400-404.

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