正单链RNA(+ssRNA)病毒是自然界中含量最丰富的真核生物病毒，需要使用基因组+RNA作为复制模板合成-RNA。植物和动物+ssRNA病毒的RNA中含有小的开放阅读框(ORF)（反向ORF[rORF]）。利用芜菁花叶病毒(Tumv)作为植物+ssRNA病毒的模型，证明了rORFs编码的小蛋白具有特定的亚细胞定位，并通过质谱分析证实rORF2在感染细胞中的存在。TuMV rORF2编码的蛋白质形成点状颗粒，定位于核周区域，并与病毒复制复合体共定位。RORF2蛋白可以直接与病毒RNA依赖的RNA聚合酶相互作用，rORF2的突变完全消除了病毒的侵染，而rORF2的异位表达拯救了突变的病毒。此外，SARS-CoV-2的RNA具有抑制I型干扰素产生和促进水泡性口炎病毒侵染的作用。作者提供了TuMV可能利用内部核糖体进入位点来翻译这些小rORF的证据。综上所述，这些发现表明+ssRNA病毒的-RNA也可以具有编码能力，其中编码的小蛋白在病毒侵染中发挥关键作用。

马铃薯Y病毒科、南方菜豆花叶病毒科、冠状病毒科和黄病毒科病毒的基因组序列分析发现了许多编码超过10个氨基酸的蛋白质的ORFs，与+RNA中已知的ORFs类似，这些病毒的RNA在每个科内选定的病毒子集中具有高度代表性（图1A–D）。由于这些ORFs是在病毒+RNA的反向互补序列中预测的，所以将它们命名为rORFs（图1E）。

在TuMV中鉴定出几个小rORFs、rORF1-rORF4，并发现在马铃薯Y病毒科中有大量匹配（图1A和2A）。TuMV-rORF1–rORF3编码的蛋白质与黄色荧光蛋白(YFP)融合，定位于细胞核、核周区域和细胞质，而rORF4仅限于核周区域（图2B）。TuMV rORF1-YFP定位在叶绿体周围，并与过氧化物酶体标记DsRed-SKL共定位，但不与高尔基体标记共定位（图2C），与叶绿素自发荧光和ER标记mCherry-HDEL（his-asp-glu-leu在其N末端融合mCherry蛋白）的共定位发现TuMVrORF3-YFP在叶绿体和内质网(ER)中（图2D）。马铃薯Y病毒科复制发生在细胞质膜结合的VRC中，在细胞核附近可以看到密集的块状物。使用表达青色荧光蛋白(CFP)标记的病毒RdRP(NIb)和mCherry标记的叶绿体定位膜蛋白(6K2)的TuMV-6K2-mCherry-CFP-NIb感染性克隆（图2E），可以发现这些rORF编码的蛋白质在病毒侵染过程中被招募到VRC中复制（图2F）。四种新蛋白均与6K2诱导的TuMVVRC和dsRNA共定位，这些rORF在病毒复制过程中VRC的形成和活性中具有潜在作用（图2G-H）。

所有突变病毒在接种后60h时均呈现出明显较少的RNA和蛋白质积累（图3A-C）。接种后5d和12d，TuMV-GFP-mrORF2未能在接种植物的全身组织中检测到病毒RNA和CP；rORF1、rORF3或rORF4的突变对TuMV症状和病毒积累的影响较轻微（图3D-H）。

除P3NPIPO外，rORF2蛋白与已报道的TuMV蛋白同时被检测到（图4A-B）。PVX-rORF2在28d时表现出严重的症状（图4C）。此外，PVX载体表达的rORF2基因可以弥补接种TuMV-GFPmrORF2突变体的本氏烟草中rORF2的缺失（图4D-F）。RORF2-YFP的转基因表达恢复了TuMV-mrORF2-GFP的感染（图4G-I）。

rORF2和11种典型TuMV蛋白酵母双杂交(Y2H)测定发现rORF2编码的蛋白质与酵母细胞中的NIb相互作用（图4J）。红色荧光蛋白(RFP)-H2B转基因本氏烟草植物叶子的双分子荧光互补(BiFC)，证实体内相互作用发生在植物细胞的细胞质中（图4K）。NIb与TuMV感染细胞VRC中的rORF2相互作用（图2F和4K），进一步表明rORF2参与TuMV复制。

使用SARS-CoV-2作为模型（图5A）推测由rORFs编码的蛋白质尺寸较小(<10kDa)，rORFs在SARS-CoV-2相关变体(VOC)中也完全保守（图5B）。rORF3编码的蛋白质预计包含两个跨膜结构域（图5C）。SARS-CoV-2 rORF编码蛋白的GFP标记，三种融合GFP的rORF编码蛋白均积累到相当的水平，但在HEK293T细胞中出现不同的亚细胞定位。GFP-rORF1分布在细胞核和细胞质中，GFP-rORF2主要位于细胞核中，GFPrORF3主要分布在细胞质中（图5D-E）。

标记SARS-CoV-2的rORF1-3可以降低维甲酸诱导基因IRIG-IN诱导的干扰素β启动子活性（图6A）。SARS-CoV-2 rORF2和ORF6可明显抑制外源干扰素-α诱导的ISRE启动子的活性（图6B）。

与表达GFP的细胞相比，表达N-FLAG的细胞中每个细胞可检测的SG面积显著减少，并且N蛋白与SG中的G3BP1共定位，表达rORF1-GFP和rORF3-GFP的细胞中SG形成显著减少（图6C和6D），表明rORF1和rORF3介导对SG形成的抑制。GFP-rORF1和G3BP1也共定位于NaAsO2处理细胞中的剩余SG（图6C），表明rORF1可能通过与G3BP1相互作用隔离G3BP1来减弱SG形成。表达单个SARS-CoV-2rORF的细胞中VSV-GFP侵染的效率显著高于对照细胞（图6E-F）。

作者设计了一个双顺反子系统（图7A）。通过农杆菌介导法将含有TuMV rORFs上游序列的双顺反子载体瞬时地表达到本氏烟草的叶片组织中（图7B）。mCherry积累的差异不是由于mRNA水平的变化所致（图7C）。用β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的序列取代驱动GFP-mCherry转录的35S启动子（图7D）。蛋白质印迹分析表明无启动子载体无法在本氏烟草叶子中表达GFP或mCherry（图7E）。qRT-PCR分析表明35S启动子驱动的表达mRNA产物在植物细胞中具有特异性条带，表明不存在隐性剪接位点（图7F）。