ICS 67.050
X 04
中华人民共和国国家标准
GB/T 18979-2003
食品中黄曲霉毒素的测定
免疫亲和层析净化高效液相色谱法
和 荧 光 光 度 法
De te r m in at io n a fla to xins content
Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy
in foodand
determination by
high-performance liquid chromatigraphy and fluorometer
2003-02-21发布2003-08-01实施
雄 宙嘉 k Wi A * 1 M 发布
GB/T 18979-2003
月明青
本标准由北京市质量技术监督局提出。
本标准由全国食品工业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:北京市产品质量监督检验所、青岛出人境检验检疫局、国家标准物质研究中心。
本标准主要起草人:王晶、张鹏、张艺兵、邵明武。
本标准为首次发布。
GB/T 18979-2003
食 品 中黄 曲霉毒素的测定
免疫亲和层析净化高效液相色谱法
和 荧 光 光 度 法
范围
本 标 准 规定了免疫亲和层析净化一高效液相色谱法和免疫亲和层析净化一荧光光度法测定食品中
黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本 标 准 适用于玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁、花生米)、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食
品中黄曲霉毒素的测定。
样 品 中 黄曲霉毒素的检出限:免疫亲和层析净化一高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B;以及黄曲霉
毒素B,,玖,G,,G 。总量检出限为 1k g/kg。免疫亲和层析净化一荧光光度法测定黄曲霉毒素B 氏、
G,,G 总量检出限为 1m g/kg,酱油样品中检出限为2.5 p g/kg.
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法
2.1 方法提要
试 样 经 过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析
净化，此抗体对黄曲霉毒素B Bz,G G:具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水
或吐温-20/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器
的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液
除非 另 有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1 甲醇(CH,OH):色谱纯。
2.2.2 甲醇一水(7+3):取70 mL甲醇加30 mL水。
2.2.3 甲醇一水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。
2.2.4 甲醇一水(45+55):取45 mL甲醇加55 mL水。
2.2.5 苯:色谱纯。
2.2.6 乙睛:色谱纯。
2.2.7 苯一乙睛(98+2):取2 mL乙睛加98 mL苯。
2.2.8 抓化钠(NaCI),
2.2.9 磷酸氢二钠(NaiH PO,),
2.2. 10 磷酸二氢钾(KHzP04).
2.2. 11 氯化钾(KCl) e
2.2 .1 2 PBS缓冲溶液:称取 8.0 g氯化钠，1.2 g磷酸氢二钠，0.2 g 磷酸二氢钾，0.2 g 抓化钾，用
990 mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1 000 ML.
2.2.1 3 吐温-20/PBS溶液(0.1 00):取 1m l一吐温-20，加人 PBS缓冲溶液并定容至 10 00m L,
2.2.1 4 pH7.0磷酸盐缓冲溶液:取 25.0 m L 0.2 m ol/L的磷酸二氢钾溶液与 29.1 m L 0.1 m ol/L的
氢氧化钠溶液混匀后，稀释到100 mL.
GB/T 18979- 2003
2.2. 15 黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素B B2,G G):纯度)9900
2-2. 16 黄曲霉毒素标准储备溶液:用苯一乙睛(98+2)溶液分别配制。. 100 mg/mL的黄曲霉毒素B, ,
B2,G,,G:标准储备液，保存于4℃备用。
2.2. 17 黄曲霉毒素混合标准工作液:准确移取适量的黄曲霉毒素B B 2,G G:标准储备液，用苯一乙
睛(98+2)溶液稀释成混合标准工作液。
2.2. 18 柱后衍生溶液(0.05%碘溶液):称取。. 1 g碘，溶解于20 mL甲醇后，加纯水定容至200 mL,
以0. 45 jam的尼龙滤膜过滤,4℃避光保存。
2.3 仪器和设备
实 验 室 常规仪器、设备及下列各项。
2.3. 1 高速均质器:18 000 r/min-22 000 r/mine
2.3.2 黄曲霉毒素免疫亲和柱。
2.3.3 玻璃纤维滤纸:直径11 cm，孔径1. 5 pme
2.3.4 玻璃注射器:10 mL,20 mLa
2.3.5 玻璃试管:直径12 mm，长75 mm，无荧光特性。
2.3.6 高效液相色谱仪:具有360 nm激发波长和大于420 nm发射波长的荧光检测器。
2.3.7 空气压力泵。
2.3.8 微量注射器:100 KLe
2.3.9 色谱柱:C,，柱(柱长150 mm，内径4.6 mm，填料直径5 pm) e
2.4 分析步骤
2.4. 1 提取
2.4.1.1 大米、玉米、小麦、花生及其制品:准确称取经过磨细(粒度小于2 mm)的试样25. 0 g于
250 mL具塞锥形瓶中，加人5. 0 g氯化钠及甲醇一水(7+3)至125.0 mL(V,)，以均质器高速搅拌提取
2 min。定量滤纸过滤，准确移取15.0 mL(V2)滤液并加人30.0 mL(V,)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤
1-2次，至滤液澄清，备用。
2.4.1 .2 植物油脂:准确称取试样 25.0 g 于 250m L具塞锥形瓶中，加人 5.0 g 氯化钠及加人甲醇一水
(7+3)至 125.0m L(V,)，以均质器高速搅拌提取 2m in。定量滤纸过滤，准确移取 15.0 M l-(V2)滤液
并加人30. 0 mL(矶)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。
2.4.1.3 酱油:准确称取试样 50.0 g 于 250.0 mL具塞锥形瓶中，加人 2.5 g氯化钠及加人甲醇一水
(8十2)至100.0 mL(V4)，以均质器高速搅拌提取1 mine定量滤纸过滤，准确移取10. 0 mL(V )滤液
并加人40.0 mL(V,)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。
2.4.1.4 食醋:准确称取 5.0 g 样品，加人 1.0 g 氯化钠，以pH7.0 磷酸盐缓冲溶液稀释至 25.0 m L
(V,),混匀，定量滤纸过滤。取 10.0 nt L(矶)滤液加人 10.0m L(认 )缓冲液，混匀，以玻璃纤维滤纸过
滤1-2次，至滤液澄清，备用。
2.4.2 净化
2.4.2. 1 大米、玉米、小麦、花生及其制品、植物油脂:将免疫亲和柱连接于20. 0 ml玻璃注射器下。
准确移取15.0 mL(V4)样品提取液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使
溶液以约6 mI./min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2 mL-3 mL空气通过柱体。以10 mL水淋洗柱
子两次，弃去全部流出液，并使2 mL-3 mL空气通过柱体。准确加人1.0 mL(V)色谱级甲醇洗脱，流
速为1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。
2.4.2.2 酱油:将免疫亲和柱连接于 10.0 m L玻璃注射器下。准确移取 10.0 mL(叭)酱油样品提取
液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6 ml-/min流速缓慢通过
免疫亲和柱。用10 mL 0. 1肠的吐温一20/PBS清洗，再以10 m1_水清洗柱子两次，弃去全部流出液，并
使2 mL-3 mL空气通过柱体。准确加人1.0 mL
收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。
2.4.2.3 食醋:将免疫亲和柱连接于 10.0 m L玻璃注射器下。准确移取 10.0 mL(V,)食醋样品提取
液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6 ml-/min流速缓慢通过
免疫亲和柱，用10 mL 0. 1写的吐温-20/PBS溶液清洗，再以10 mL水清洗柱子两次，弃去全部流出液，
并使2 mL-3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL(V)色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min-
2 mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。
2.4.3 测定
2.4.3. 1 高效液相色谱条件
流 动 相 :甲醇一水(45+55)
流速 : 。 8M L/min
柱 后 衍 生化系统
衍 生 溶 液:。.05%碘溶液
衍 生 溶 液流速:0.2 m L/min
反 应 管 温度:700C
反 应 时 间:1m in
2.4.3.2 定量
用进 样 器 吸取100p L黄曲霉毒素混合标准工作液(2.2.17)注人高效液相色谱仪，在上述色谱条件
下测定标准溶液的响应值(峰高或峰面积)，得到黄曲霉毒素B B2,G,,G:标准溶液高效液相色谱图。
参考谱图见图1.
面暇肆怜粗权
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41Fka20
招16 14 招10 8
保留时间/min
图 1 黄 曲 霉 毒 素 B, ,B 2, G G 2 的 标 准 谱 图
取 样 品 洗脱液 1.0 m L加人重蒸馏水定容至 2.0 m L，用进样器吸取 100p L注人高效液相色谱仪，
在上述色谱条件下测定试样的响应值(峰高或峰面积)。经过与黄曲霉毒素标准溶液谱图比较响应值得
到试样中黄曲霉毒素 B,、 B2 ,G ,和G:的浓度 :。
2.4.4 空白试验
用 水 代 替试样，按 2.4.1-2.4.3步骤做空白试验。
2.4.5 结果计算
样 品 中 黄曲霉毒素 B B2,G 1或 G:的含量(X,)以微克每千克表示，按式(1)计算:
(c:一ca )·V
W
(1)
GB/T 18979- 2003
其中:
w一署X(v 开3)XV 4 ，......⋯ ⋯ 。.·....···⋯ ⋯ (2)
式中:
X,— 样品中黄曲霉毒素B, ,氏,G，或G:的含量，单位为微克每千克伽g/kg);
c,— 试样中黄曲霉毒素B B,,G，或G:的含量，单位为微克每升(pg/L) ;
‘。— 空白试验黄曲霉毒素B B2,G，或G:的含量，单位为微克每升(f'g/L );
V— 最终甲醇洗脱液体积，单位为毫升(mL) ;
W— 最终净化洗脱液所含的试样质量，单位为克〔9);
，— 试样称取的质量的数值，单位为克(g);
V,— 样品和提取液总体积，单位为毫升(mL) ;
V2 稀释用样品滤液体积，单位为毫升(mL) ;
V3 稀释液体积，单位为毫升(mL) ;
叭通过亲和柱的样品提取液体积，单位为毫升(mL) ,
黄曲霉毒素总量为B B2,G,,G2的浓度之和，即B,+ B2+ G,+ G2,
计算结果表示到小数点后两位。
免疫亲和层析净化荧光光度法
3.1 方法提要
试 样 经 过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析
净化，此抗体对黄曲霉毒素 B B2, G G:具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水
将免疫亲和柱上杂质除去.以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加人澳溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗
脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素(B,+ 玖+G,十G2)总量。
3.2 试剂和溶液
除非 另 有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水
3.2.1 甲醇(CH30H):色谱纯。
3.2.2 甲醇一水(7+3):取70 mL甲醇加30 mL水。
3.2.3 甲醉一水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。
3.2.4 抓化钠(NaCD,
3.2.5 磷酸氢二钠(NatH PO,) 。
3.2.6 磷酸二氢钾(KH2P O,)o
12. 7 氯化钾(KCl)
3.2.8 澳溶液储备液(0.0 1%):称取适量澳，溶于水，配成 0.01%的储备液，40C避光保存。
3.2.9 澳溶液工作液(0.002写):取 10m L0 .0 1%的澳溶液加人 40m L水混匀，于棕色瓶中保存备用。
需每次使用前配制。
3.2.1 0 二水硫酸奎宁(C,oH z,N zO z·H2SO4，2Hz0),
3.2.1 1 硫酸溶液(0.0 5m ot/L):取 2.8 m L浓硫酸，缓慢加人适量水中，冷却后定容至 10 00m L.
3.2.12 荧光光度计校准溶液:称取3.40 g 硫酸奎宁(CzoH z,N ,0 2·HzS04·2H20)用0.0 5m ot/L硫
酸溶液稀释至100 mL，此溶液荧光光度计读数相当于20 has/L黄曲霉毒素标准溶液。
3. 3 仪器和设备
实 验 室 常规仪器、设备及下列各项。
3.3. 1 荧光光度计。
3.3.2 高谏均质器.18 000 r/min--22 000 r/min
GB/T 18979-2003
3.3.3 黄曲霉毒索免疫亲和柱。
3.3.4 玻璃纤维滤纸:直径11 cm，孔径1.5 [am.
3.3.5 玻璃注射器:10 mL,20 mI。
3.3.6 玻璃试管:直径12 mm，长75 mm，无荧光特性。
3.3.7 空气压力泵。
3，4 分析步骤
3.4. 1 提取
同 2.4 .1 ,
3.4.2 净化
同 2. 4. 2,
3.4.3 测定
3.4.3. 1 荧光光度计校准
在 激 发 波长 360r an，发射波长450n 条件下，以。.05m ol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的
读数值为 。.。Fag/L;以荧光光度计校准溶液(3.2.12)调节荧光光度计的读数值为 20.0 F ag/L,
3.4.3.2 样液测定
取上 述 净 化后的甲醇洗脱液加人1.0 m L0 .0 020 o澳 溶液，混匀，静置1m in，按3.4.3.1条件进行
操作，于荧光光度计中读取样液中黄曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的浓度。(Kg/L)e
3.4.4 空白试验
用 水 代 替试样，按 3.4.1--3.4 .3 步骤做空白试验。
3.4.5 结果计算
样 品 中 黄曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的含量(X2)以微克每千克表示，按式(3)计算 :
(c:一CD )·V
W
(3 )
其中:
W一V,X V 2
(V2 + V,)
X V, (4)
式中:
X2— 样品中黄曲霉毒素(B, +残十G 十G2)含量，单位为微克每千克伽g/kg),
c2— 试样中黄曲霉毒素(B，十Bz +G,十G )的含量，单位为微克每升(FHB/L) ;
‘。— 空白试验黄曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的含量，单位为微克每升恤B/L);
V— 最终甲醇洗脱液体积，单位为毫升(mL) ;
W— 最终净化洗脱液所含的试样质量，单位为克(9);
。— 试样称取的质量的数值，单位为克(9);
V,— 样品和提取液总体积，单位为毫升(ML) ;
V— 稀释用样品滤液体积，单位为毫升(mL) ;
V 稀释液体积，单位为毫升(mL);
V,— 通过亲和柱的样品提取液体积，单位为毫升(mL) o
计算结果表示到小数点后一位。