免疫疗法的诞生和发展是本世纪癌症治疗领域里程碑式的进步[1]，对于众多因传统治疗不耐受或无缓解而深陷绝望的患者来说，免疫疗法很有可能为他们提供一根新的救命稻草。免疫检查点抑制剂在免疫疗法中最富前景，已有数款免疫检查点抑制剂获批上市[2]。然而，由于免疫抑制性肿瘤微环境的存在以及肿瘤细胞与免疫系统间的相互作用，免疫检查点抑制剂的响应率仍然很低，只有20-30%的患者能从中获益[3]。肿瘤微环境由多种细胞组成，包括肿瘤细胞、调节性T细胞 (Treg)、成纤维细胞和肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)等。TAM在瘤内含量丰富，占肿瘤质量的近50% [4]，而且TAM的存在通常与肿瘤预后不良有关[6]。因此，重编程TAM细胞，以恢复其肿瘤杀伤功能引起了人们极大的兴趣，正发展为一种改善肿瘤免疫治疗效果的富有前景的新兴疗法[5]。

但重编程后，TAM易受肿瘤微环境中抑制性因子如IL-4、IL-13、IL-10和M-CSF等的影响，倾向于转化回促肿瘤生长的TAM[6]。因此，免疫检查点阻断与肿瘤微环境重塑相结合，是肿瘤免疫治疗领域有巨大前景的重要发展方向。2021年12月24日，北大药学院齐宪荣教授团队在Nano Today发表题为CRISPR-based in situ engineering tumor cells to reprogram macrophages for effective cancer immunotherapy的研究文章，并报道了一种名为HPT-PFs的选择性响应基因加速递送系统，成功将黑色素瘤细胞原位编辑为CD47敲除且生产IL-12的工程细胞，使移植瘤在小鼠体内的生长受到了显著抑制。该项研究表明，CRISPR介导的CD47阻断与肿瘤细胞中IL-12生产的结合可以协同促进巨噬细胞介导的免疫治疗，为基于CRISPR的肿瘤细胞原位基因编辑应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。

研究团队利用肿瘤中高表达CD44受体和基质金属蛋白酶 (MMPs) 的特性，设计出了选择性响应加速基因递送系统 (HPT-PFs)，将CD47阻断与IL-12产生结合，对肿瘤细胞进行原位改造用于巨噬细胞介导免疫治疗。该系统首先用氟化的聚乙烯亚胺模块 (PF) 与质粒形成复合物内核以提高细胞摄取、DNA内体逃逸和解离的几率，从而实现递送效率的大幅提高[7-9]。然后，作者引入透明质酸 (HA) 和肿瘤微环境敏感肽 (TMSP)，作为肿瘤选择性响应模块 (HA-PEG-TMSP，简称HPT)，进一步包覆在内核上以提高肿瘤靶向性和被细胞内化的几率（图1）。TMSP由细胞穿透肽 (CPP) 和MMPs可切割肽接头 (PVGLIG) 连接的屏蔽肽组成，屏蔽肽在肿瘤部位被过表达的MMP 选择性切除，并因此暴露CPP以促进细胞摄取而实现基因靶向递送。

图1. HPT-PFs 纳米粒子组装设计示意图

 

随后，作者通过一系列细胞水平实验，评估了HPT-PFs系统在体外递送基因的性能。与传统递送载体相比，HPT-PFs递送后CD47敲除率显著升高。同时，成功编辑的B16F10小鼠黑素瘤细胞能转化为IL-12生产工厂，并增强巨噬细胞对自身的吞噬。接着，团队通过皮下注射 B16F10细胞的方式构建了荷瘤小鼠模型，在体内证明HPT-PFs能显著抑制肿瘤生长（图2. a-c），并促进肿瘤细胞凋亡（图2. d,e）。

图2.HPT-PFs 纳米粒的体内抗肿瘤疗效

为进一步确认HPT-PFs的体内递送效率和抗肿瘤机制，作者使用Bioss抗体，通过IHC检测了肿瘤组织切片中CD47的表达情况。结果显示：在HPT-PFs (CD47) 组和HPT-PFs (CD47-IL12) 组中观察到CD47表达降低（图3. a），证明了HPT-PFs在体内也能有效地介导基因递送，敲除CD47，实现对肿瘤细胞的原位编辑。IL-12是促进巨噬细胞M1极化的重要细胞因子[10]。为进一步探究原位编辑工程肿瘤细胞对TAM极化倾向的影响，研究团队使用Bioss抗体对肿瘤组织进行IF检测（图3. b）。结果显示：在HPT-PFs (CD47-IL12) 组中M1型的巨噬细胞 (CD86+) 显著增加，而M2型的巨噬细胞 (CD206+) 显著减少，并产生了更多的TNF-α（图3. b）。以上结果说明肿瘤组织中的TAM发生了重编程，并转化为了具有促炎和免疫监视功能的M1型的巨噬细胞。先前的研究表明，抑制血管形成是IL-12的关键抗肿瘤机制。该过程依赖于IFN-γ的分泌[11]。因此，作者继续检测了肿瘤组织切片中的IFN-γ和血管生成情况。在HPT-PFs (CD47-IL12) 组中发现IFN-γ水平显著升高，且CD31阳性信号减少，标志着肿瘤血管生成受到了显著的抑制（图3. b）。总的来说，这些结果表明肿瘤CD47阻断与IL-12生产的组合疗法可以重编程TAM从而实现有效的抗肿瘤效应。

图3. HPT-PFs 原位编辑的肿瘤细胞使TAM 重编程并发挥抗肿瘤功效

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参考文献

1.Meng L., Zhenzhen Y., et al. (2022). CRISPR-based in situ engineering tumor cells to reprogram macrophages for effective cancer immunotherapy. Nano Today, 32, 10359.

2.Menon, S., Shin, S., & Dy, G. (2016). Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers, 8(12), 106.

3.Maleki Vareki, S., Garrigós, C., & Duran, I. (2017). Biomarkers of response to PD-1/PD-L1 inhibition. Critical reviews in oncology/hematology, 116, 116–124.

4.Cassetta, L., & Pollard, J. W. (2018). Targeting macrophages: therapeutic approaches in cancer. Nature reviews. Drug discovery, 17(12), 887–904.

5.Singh, Y., Pawar, V. K., Meher, J. G., et al. (2017). Targeting tumor associated macrophages (TAMs) via nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 254, 92–106.

6.Gajewski, T. F., Schreiber, H., & Fu, Y. X. (2013). Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature immunology, 14(10), 1014–1022.

7.Yang, J., Zhang, Q., Chang, H., & Cheng, Y. (2015). Surface-engineered dendrimers in gene delivery. Chemical reviews, 115(11), 5274–5300.

8.Lv, J., Chang, H., Wang, Y., et al. (2015). Fluorination on polyethylenimine allows efficient 2D and 3D cell culture gene delivery. Journal of materials chemistry. B, 3(4), 642–650.

9.Wang, H., Wang, Y., Wang, Y., Hu, J., et al. (2015). Self-Assembled Fluorodendrimers Combine the Features of Lipid and Polymeric Vectors in Gene Delivery. Angewandte Chemie (International ed. in English), 54(40), 11647–11651.

10.Barberio, A. E., Smith, S. G., Correa, S., et al. (2020). Cancer Cell Coating Nanoparticles for Optimal Tumor-Specific Cytokine Delivery. ACS nano, 14(9), 11238–11253.

11.Voest, E. E., Kenyon, B. M., O'Reilly, M. S., et al. (1995). Inhibition of angiogenesis in vivo by interleukin 12. Journal of the National Cancer Institute, 87(8), 581–586.