抑郁症是一种常见的精神障碍疾病，影响人群超过3亿，它是导致残疾的主要原因之一。然而，抑郁症相关机制尚不清楚。近年来，肠-脑轴被认为是抑郁症的新靶点，但缺乏关于抑郁症-肠道菌群的纵向研究。来自西班牙的José Manuel Fernández-Real和Rafael Maldonado团队通过多队列临床样本和多组学方法来揭示依赖于肠道菌群的脯氨酸代谢变化对抑郁症的影响，并提示靶向菌群/膳食脯氨酸或可有效改善抑郁，相关研究成果发表于《Cell Metabolism》。
研究重点解析
1. 膳食和血浆脯氨酸与抑郁严重程度显著正相关
2. 血浆脯氨酸水平取决于肠道菌群组成和功能
3. 补充脯氨酸加剧小鼠抑郁样行为
4. 脑铁沉积和rich-club网络破坏与抑郁和脯氨酸有关
5. 粪菌移植促进小鼠抑郁并增加脯氨酸/GABA转运蛋白基因水平
6. 敲低脯氨酸/GABA转运蛋白基因可抵御果蝇抑郁状态
7. 植物乳杆菌的单菌定植可改善果蝇抑郁状态
宏基因组揭示抑郁评分相关特定菌群及功能
首先对纵向发现队列（IRONMET，n=116）粪便样本进行宏基因组分析，其中非抑郁症（n=44)、轻度抑郁(n=47)和重度抑郁受试者(n=25)，结合抑郁筛查量表评分（PHQ-9）筛选菌群组成和功能与抑郁症的关系。结果显示，alpha多样性指数或香农指数在组间无显著差异；然而，非抑郁个体的Fisher’ alpha多样性指数高于抑郁个体，在轻度和重度抑郁症之间无显著差异。β多样性的主成分分析(PCA)结果表明，非抑郁受试者和抑郁受试者之间菌群组成存在显著差异。对于每个分类群经年龄、性别、体重指数(BMI)、受教育年限以及抗抑郁药和焦虑药物校正后，筛选出30种与抑郁症显著相关的菌种。其中，PHQ-9评分与Parabacteroides spp.、Acidaminococcus spp.呈正相关，而与Bifidobacterium pseudolongum和毛螺菌科中产丁酸盐的菌种呈负相关。纵向比较表明，较低水平的放线菌（双歧杆菌属和柯林斯菌）和毛螺菌以及较高水平的普雷沃氏菌和肠杆菌与1年后较高的PHQ-9评分有关。
在功能上，经年龄、性别、BMI、教育年限、抗抑郁药和抗焦虑药校正后，与PHQ-9评分显著相关的菌群功能涉及精氨酸、脯氨酸和组氨酸代谢通路且与PHQ-9评分呈负相关，此外，谷氨酸代谢、谷氨酸能突触和GABA能突触与PHQ-9评分显著相关。一些具有强关联的细菌也参与了TCA循环。溶质载体家族6(SLC6)也与PHQ-9评分呈负相关。其中，SLC6主要编码神经递质（例如GABA、单胺、甘氨酸和脯氨酸）转运蛋白，也编码蛋白氨基酸、甜菜碱、牛磺酸和肌酸（图1），与GABA能突触变化一致。
图1. 抑郁症评分相关肠道菌群组成和功能变化
代谢组学揭示抑郁评分与组氨酸、精氨酸、脯氨酸降解通路有关
对血浆和粪便样本进行代谢组学分析，基于机器学习变量选择策略筛选出几种与PHQ-9评分相关的代谢物，这些代谢物参与了TCA循环（琥珀酸和富马酸）、组氨酸代谢（尿刊酸）以及脯氨酸和谷氨酸代谢，与之前研究结果一致。随后，通过另一个独立验证队列（IMAGEOMICS，n=919）血浆样本进行验证，该队列也由非抑郁、轻度和重度抑郁受试者组成。其中两个队列一致发现血浆脯氨酸与抑郁评分的强正相关。将发现队列（IRONMET）中与PHQ-9评分显著相关的代谢物进行通路富集分析，结果表明，TCA循环、氧化磷酸化、谷氨酸代谢以及精氨酸、脯氨酸和组氨酸分解代谢相关的通路显著富集，结果也强调了SLC和氨基酸转运蛋白以及GABA合成/降解通路及其通过GABA分流与TCA循环的联系，这些变化主要与哺乳动物大脑中的神经传递有关。其中，图2H总结了与抑郁症相关的主要代谢物和菌群功能（图2）。
图2. 代谢组学揭示抑郁评分相关血浆和粪便代谢物
血浆脯氨酸水平取决于肠道菌群组成和功能
由于饮食对肠道菌群组成和代谢活动有很大影响，采用食物频率问卷对常规营养素、维生素、矿物质、氨基酸和脂肪酸与发现队列（IRONMET）PHQ-9评分进行分析。结果显示，脯氨酸是对抑郁症影响最大的饮食因素。根据血浆脯氨酸和膳食脯氨酸水平将受试者分为4组：HPD-HPP（高膳食脯氨酸水平-高血浆脯氨酸水平），LPD-LPP（低膳食脯氨酸水平-低血液脯氨酸水平）、HPD-LPP、LPD-HPP。结果显示，LPHQ-9评分从高到低依次为HPD-HPP、LPD-HPP、HPD-LPP、LPD-LPP。由于脯氨酸与抑郁症的关联最为一致，进一步分析了血浆脯氨酸与肠道菌群的关联，结果表明，血浆脯氨酸水平与PHQ-9评分相关的菌群特征存在相关性。血浆脯氨酸与Parabacteroides和普雷沃氏菌属呈正相关；与放线菌（包括双歧杆菌）和毛螺菌科产SCFA菌呈负相关。与低血浆脯氨酸组（LPP）相比，高血浆脯氨酸组（HPP）Parabacteroides和Acidaminococcus的种水平较高，但双歧杆菌属和毛螺菌科水平较低，特别是Roseburia spp.。HPD-LPP组和HPD-HPP组具有不同的菌群组成，HPD-LPP组菌群组成与抑郁评分较低相关的菌群组成一致。功能上，HPD-LPP组在脯氨酸转运和代谢上显著富集，且与PHQ-9评分相关的菌群基因有关，这提示HPD-LPP组的肠道菌群增强脯氨酸的代谢和转运，降低血液中脯氨酸水平，进而缓解抑郁。（图3）。
图3. 饮食和血浆脯氨酸与抑郁评分和肠道菌群有关
RNA测序揭示与高脯氨酸消耗有关的基因
由于膳食脯氨酸主要被小肠中的肠细胞代谢，对另一个独立队列（INTESTINE队列，n=28）的空肠样本进行RNA测序。差异基因表达分析结果表明，1,547个基因转录本与膳食脯氨酸有关。功能分析发现其参与GABA受体激活、突触相互作用和轴突引导的通路，还参与细胞外基质(ECM)、肌肉收缩、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导和G蛋白偶联受体（GPCR）信号传导的通路（图4）。
补充脯氨酸加剧小鼠抑郁样行为
为了进一步研究膳食脯氨酸对抑郁症的直接影响，采用小鼠模型进行验证。给20只CD-1小鼠喂食标准饮食(SD)，其中补充脯氨酸(36g/L)或水（对照组）。在整个实验过程中，小鼠长期暴露于不可预测的轻度压力源（UCMS模型），在UCMS暴露6周后，实验组之间的体重或饮用水无显著差异。与补充水的对照小鼠相比，补充脯氨酸的小鼠血浆脯氨酸水平显著升高。与只补充水且无压力的对照小鼠相比，补充脯氨酸组在悬尾测试中不动时间更长，并蔗糖摄入量减少，这是抑郁症的核心症状。此外，与对照组相比，UCMS+脯氨酸小鼠的血清脂多糖结合蛋白(LBP，细菌易位的标志物）水平更高，这表明菌群发生易位，并与人的结果一致（图4）。
图4. 膳食脯氨酸与空肠RNA有关
脑铁沉积和全脑功能动力学揭示与抑郁症和脯氨酸相关的rich-club网络破坏
由于铁在谷氨酸和GABA稳态中起着至关重要的作用，使用磁共振成像(MRI)评估IRONMET队列患者大脑中铁沉积情况。脑区松弛测量参数（AAL Atlas）和PHQ-9评分之间的相关性分析表明，扣带和额叶相关区域的低铁沉积与抑郁症呈正相关。对验证队列（IMAGEOMICS）一部分患者(n=591)进行静息状态功能磁共振成像（fMRI）研究，并采用机器学习算法识别预测PHQ-9评分节点，共筛选出72个与抑郁症相关的节点，68个与血浆脯氨酸水平相关的节点，其中30个与PHQ-9评分相关，且这些区域大多属于rich-club区域（一组高度节点，它们之间连接更紧密）（图5）。
图5. 脑铁沉积和脑网络与抑郁评分和血浆脯氨酸相关研究
粪菌移植验证抑郁与脯氨酸和GABA转运有关
将来自20名不同PHQ-9评分的患者供体粪菌移植（FMT）到20只抗生素处理的小鼠中，采用恐惧条件诱导冷冻测试（一种公认的对压力不适应反应模型）评估受体小鼠是否出现情绪受损。结果表明，供体的PHQ-9评分与受体小鼠的冷冻时间显著相关。供体PHQ-9评分与受体小鼠菌群特征存在相关，该特征与人类抑郁症相关的特征一致，与Acidaminococcus和普雷沃氏菌属呈正相关，与放线菌门（尤其是双歧杆菌和柯林斯菌）和产SCFA的毛螺菌科呈负相关。
考虑到菌群对谷氨酸能和GABA能的影响，对受体小鼠的内侧前额叶皮层(mPFC)进行RNA测序，结果表明，在受体小鼠mPFC中确定了59个转录本与供体PHQ-9评分显著相关；且44个转录本与受体小鼠冷冻时间相关，包括slc6a12、slc6a13和 slc6a20a。通路的过表征分析（ORA）表明，与供体PHQ-9评分负相关的50%转录本都聚集在一起，并与氧化磷酸化和神经退行性疾病有关。且鉴定出与PHQ-9评分相关基因簇，包含编码GABA转运蛋白（slc6a12和slc6a13）和脯氨酸转运蛋白（slc6a20）的基因转录本，与功能分析结果一致。这些结果与代谢组、宏基因组结果一致，再次强调了TCA循环与GABA、谷氨酸代谢、以及脯氨酸-谷氨酸-GABA-菌群相互作用的重要性（图6）。
图6. 粪菌移植后情绪受损表型与mPFC转录水平相应改变
敲低脯氨酸/GABA转运蛋白基因可抵御果蝇抑郁状态
为了确定这些脑转运蛋白在抑郁症中的作用，连续5天（STAR方法）对黑腹果蝇进行12小时机械压力重复刺激。结果显示，与无压力组相比，压力组果蝇攀爬尝试显著减少，食欲降低，运动的总步行距离和速度降低，显示自愿行为活动减少和整体缺乏动力，为抑郁常见症状。在果蝇神经元细胞中，敲低脯氨酸转运蛋白CG43066（slc6a20同源体）后，压力组与无压力组在攀爬试验、运动能力等行为实验中无明显差异，即压力组不再表现出明显的抑郁样行为。敲低果蝇神经胶质细胞GABA转运蛋白Gat（Slc6a12和Slc6a13同源体），也一定程度上改善压力组的抑郁行为，表明神经胶质细胞中Gat对抑郁样状态具有保护作用（图7）。
植物乳杆菌（L. plantarum）单菌定植可改善果蝇抑郁状态
虽然Acidaminococcus和双歧杆菌在人类和粪菌移植实验中与抑郁症最一致，但这两个都不是果蝇菌群成员。因此，选择了2种先前报道的果蝇菌群物种，且与抑郁症呈负相关的植物乳杆菌（高GABA生产者）和阴沟肠杆菌（低GABA生产者）分别进行单菌定植。结果表明，在无菌和阴沟肠杆菌单菌定植雄性果蝇中观察到攀爬动机显著降低，但在植物乳杆菌单菌定殖中无改变。在无菌和定植阴沟肠杆菌应激的雌性果蝇中出现食欲不振，而定植植物乳杆菌后食欲不振则显著改善。表明定植高GABA生产者植物乳杆菌对果蝇抑郁状态具有保护作用（图7）。
图7. 敲低果蝇脯氨酸转运蛋白和单菌定殖的保护作用
小结
本研究利用3个临床队列，结合代谢组、宏基因组、RNA测序等分析手段以及小鼠和果蝇模型，探究了肠道菌群、代谢物与抑郁症的关系。揭示了依赖于肠道菌群的脯氨酸代谢变化对抑郁症的影响，强调脯氨酸-谷氨酸-GABA-菌群互作在抑郁症中的重要性，也提示靶向菌群或减少膳食脯氨酸或可有效改善抑郁。
参考文献
Microbiota alterations in proline metabolism impact depression. Cell Metabolism. 2022.
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