背景介绍

已知，生物技术药物是指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。而蛋白质药物又包含多肽、单克隆抗体、基因工程抗体和重组疫苗等。因此，如何表达生产稳定性高、纯度好、质量均一的蛋白质是这些蛋白药物的关键。蛋白表达系统的选择对于研发和生产高效蛋白质产品就变得尤为重要了，不同的表达系统提供了多种途径，以满足对于表达水平、折叠状态、纯度和可溶性等方面的不同需求。

目前常用的表达系统主要有：原核表达系统和真核表达系统两大类，而原核表达系统中较常用的是大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统，真核表达系统中较常用的是酵母表达系统（eg.酿酒酵母和毕赤酵母）、哺乳动物细胞表达系统（eg.CHO细胞、HEK293细胞等）和昆虫/杆状病毒表达系统。其中，昆虫/杆状病毒表达系统被认为是最具潜力的表达系统。

昆虫/杆状病毒表达系统

用杆状病毒做载体，可高效表达外源基因。由于其可以对真核蛋白进行翻译后加工等过程而被广泛地用于真核基因的体外表达。到目前为止，已有近千种异源蛋白在此系统中得到高效表达。这个表达体系的主要特点是可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。这一特点优于细菌、酵母和哺乳动物细胞表达体系。由于这个载体系统独特的性质，使其被广泛地应用于药物开发、疫苗、促生长因子、抑癌基因蛋白产物、免疫活性分子和基因表达调控等多个领域的研究中。

由于昆虫是杆状病毒的自然宿主，且每种杆状病毒都只能感染一种或几种昆虫，不会感染其他动物、植物及人类，所以认为在应用杆状病毒进行研究时不需考虑其安全性问题。

杆状病毒表达系统（Baculovirus expression system，BVES）就是以杆状病毒作为外源基因载体，以昆虫细胞作为宿主进行外源蛋白生产的真核表达系统，由转移质粒、杆状病毒载体和昆虫宿主细胞系组成。BEVS最初是为了控制农业害虫而在20世纪70年代开发的，而随着COVID-19全球疫苗市场的扩张，其逐渐引起疫苗生产商的关注。BVES具有易于规模化生产、培养成本低、宿主残留对脊椎动物的生物安全性高等优势，现已作为一个成熟的外源蛋白表达平台，在疫苗生产、基因治疗和其他应用中发挥有效作用。

常用的杆状病毒载体包括苜蓿蠖核型多角体病毒（AcNPV）和家蚕核型多角体病毒（BmNPV），其中以AcMN-PV研究最为深入也最常用。应用较广的昆虫细胞系则主要有2种：草地夜蛾细胞系（Spodopteraugerda cell line，Sf），常用Sf21及其分离株Sf9细胞；粉纹夜蛾细胞系（Trichoplusia ni cell line，Tn），常用商品化的High Five™（Hi5）细胞。其中，Sf9细胞更适合于重组病毒扩增及包装，主要用于三个领域，即：生产重组蛋白、rAAV载体和疫苗。国际上已有Sf9细胞基质流感疫苗批准上市，另外还有一系列Sf9细胞系参与的生物制品正处于临床试验阶段。

风险及法规监管要求

杆状病毒-昆虫细胞（Baculovirus-Sf9）表达平台具有独特的优势，使其成为许多生物制品生产的有吸引力选择。在此情况下，建立合适的检测方法监测生产工艺，控制Sf9细胞等宿主昆虫细胞残留核酸限度，以确保产品的安全性和质量已经成为监管机构和行业内关注的重点。

严格的纯化工艺可以去除一部分宿主细胞DNA（HCD）等残留杂质成分，但产品中仍然可能会有HCD残留，这些残留的外源宿主细胞DNA会引发潜在的安全问题（如潜在致瘤性、传染性，甚至增加免疫源性或导致突变），所以HCD检测项目是生物制品生产工艺中重要的质量检测指标之一。各国的药典法规也相继出台了针对生物制品中外源宿主DNA残留量限度的规定。

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《中国药典》2020年版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂外源宿主细胞DNA残留量不能超过100pg/剂。

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《欧洲药典》（EP10.0）通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10ng/剂。

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美国食品药品监督管理局（FDA）发布的指导原则中指出生物制品宿主细胞DNA残留限度不得超过100pg/剂，对于大剂量的生物制品（如单克隆抗体），根据其残留DNA来源及给药途径，DNA残留量可放宽至10ng/剂。

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Sf9和杆状病毒(AcNPV)残留DNA的检测

现行各国药典中生物制品残留DNA检测方法主要有4种：杂交法、阈值法、荧光染料法和定量PCR法等。其中，qPCR法具有极高的灵敏度、序列特异性和准确性，可为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可靠的检测手段，现也已成为各生物制品企业首选检测方法。

针对上述情况，翌圣生物自主研发了Sf9和杆状病毒（AcNPV）DNA残留检测试剂盒，基于探针法荧光定量PCR原理，采用多重qPCR方法分别检测Sf9和杆状病毒（AcNPV）残留DNA，Sf9定量限可达1fg/μL，杆状病毒（AcNPV）定量限可达7copies/uL。还研发了与之配套使用的宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒，以及配套的自动化核酸提取仪器。

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产品资质

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符合法规：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63药典要求验证，符合国际权威机构的标准；

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配合审计：产品生产符合ISO13485质量体系标准，有完善的审计文件；

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保障品质：试剂盒所需酶原料全自产，且已产业化，供货稳定；

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技术经验积累：TaqMan法有技术沉淀，使得Kit灵敏度高；

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专注产品性能：Taq酶抗体库，双封闭抗体提高了Kit特异性、稳定性等。

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产品特点

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抗干扰性：针对复杂基质，样本加标回收率至少能达到70-130%；

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灵敏度高：定量下限(LLOQ)分别为Sf9 1fg/μL，AcNPV 7copies/uL；

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精密度高：批内重复性高CV＜10%，批间差异小即中间精密度CV＜15%；

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专属性强：特异性检测Sf9和AcNPV残留DNA，不受其他外源基因组DNA干扰；

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防干扰强：引入内部质控(IC)，可排除样本干扰、反应配制异常等，避免假阴性。

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验证完善：参考ICH Q2（R2）分析方法验证指导原则，可提供完善的验证报告。

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验证内容

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产品信息