使用PowerPlex® 16 HS系统直接扩增血卡和口腔标本卡
作者：Doug Wieczorek （Promega Corporation）
Benjamin E. Krenke （Promega Corporation）

介绍

短串联重复序列（STR）分析手段是目前法庭科学以及亲子鉴定实验室的常用技术。对于已知样本，例如亲子鉴定、受害人或嫌疑人的检测，经常使用口腔及血样标本。此类标本经常收集在特殊的卡片上，例如FTA® 以及Protein Saver® 903 卡片。这些卡片上都含有特殊的化学试剂，这种化学试剂可以裂解细胞，并且保护DNA以进行后续的检测分析。这些卡片可以在室温长时间保存，因此提供了一种简单的、稳定的、便宜的DNA样本保存途径。

通常情况下，血样和口腔样本都含有一些抑制DNA扩增的物质。以前，我们通常要从这些纸卡中提取DNA，并且进行纯化以去除抑制物。 然而，如果能够直接扩增纸片中被保护的DNA，就可以使我们更快、更高效的分析DNA样本。通过省略DNA的纯化步骤，使用者可以节省试剂的成本，也缩短了试验时间。法庭科学建库实验室和亲子鉴定实验室通常有大量的样本需要分析，因此直接扩增为这些实验室提供了一种高效、稳定的方法。

最近Promega公司推出了PowerPlex® 16 HS系统(Cat.# DC2101)，这个产品可以对16个STR位点进行联合扩增。PowerPlex® 16 HS系统加入了热启动Taq DNA聚合酶，并且与其他STR产品相比，包括原有的PowerPlex® 16系统，HS系统对PCR抑制物的耐受性更强，这一点使得PP16 HS非常适合于直接扩增。在这里，我论证了使用PowerPlex® 16 HS 系统，对FTA® 和Protein Saver® 903 卡片上的口腔和血样标本进行直接扩增的有效性.

材料与方法

11位志愿者的口腔样本使用EasiCollect™样本收集卡（Whatman, Kent, UK），按照操作手册的流程收集。11份血液样本使用Vacutainer® EDTA抗凝血液收集管（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）采集，然后制作到FTA®卡和Protein Saver® 903卡。所有样本在进行提取处理前都彻底干燥。
我们检测了打孔直径0.5-2.0 mm 范围间的卡片，最后选取1.2 mm的纸片。 我们从每张卡片上打4片1.2 mm的纸片，每1片分别放入96孔扩增板，使用PowerPlex® 16 HS系统对样本进行STR序列的直接扩增。25ul的反应体系中包含5μl 5X Master Mix，2.5μl 10X Primer Pair Mix和17.5μl Water, Amplification Grade，这些成分与纸片一起进行扩增。

扩增在GeneAmp® PCR System 9700型热循环仪上进行，扩增程序参照PowerPlex® 16 HS 系统技术手册（#TMD022，#CTMD022）。我们测试了26-32个循环，最后选取28个循环（10/18） 进行扩增。使用1μl扩增产物在ABI PRISM® 3100遗传分析仪(Applied Biosystems)上使用3 kV电压、5-second进样进行电泳检测。电泳数据使用GeneMapper® ID软件3.2版本进行分析。分析设置参照PowerPlex® 16 HS 系统技术手册（#TMD022，#CTMD022）。

结果分析

直接扩增的重要特点就是能够获得稳定的、可重复的遗传图谱结果。

EasiCollect™口腔样本卡

在44个口腔样本结果中，43份得到了完整的遗传图谱，只有一份样本的图谱位点没有出全，31个等位基因中丢失了6个。也就是说，在取的4片卡片中，有3片都得到了完整的图谱。综上所述，口腔样本得到完整图谱的成功率为98%。44份样本图谱中杂合子的峰高范围2709 ± 1659 RFU (Table 1)，大部分杂合子峰高在1000–4000 RFU之间，同一人源样本的平均峰高表现稳定。另外，位点间的平衡性也表现良好。Figure 1，Panel A显示了一份具有典型代表性的EasiCollect™口腔样本。

FTA®卡—血液样本

在44个FTA®卡血液样本结果中，43份得到了完整的遗传图谱。另外一份样本由于内标（ILS600）电泳失败，因此无法分析。因此，可分析的43分样本全部得到了完整的遗传图谱（100%）。43份样本图谱中杂合子的峰高范围1736 ± 1009 RFU (Table 1) ，大部分杂合子峰高在1000–2500 RFU。，同一人源样本的平均峰高表现稳定。Figure 1，Panel B显示了一份具有典型代表性的FTA®卡血液样本。

903卡片—血液样本

在44个903卡血液样本结果中，43份得到了完整的遗传图谱。另外一份样本由于毛细管进样差，电泳失败，因此无法分析。因此，可分析的43分样本全部得到了完整的遗传图谱（100%）。43份样本图谱中杂合子的峰高范围862 ± 516 RFU (Table 1)，大部分杂合子峰高在500–1500 RFU。，同一人源样本的平均峰高表现稳定。Figure 1，Panel C显示了一份具有典型代表性的903卡血液样本。

成功进行直接扩增需要注意的事项

由于抑制物的存在，过去使用DNA保存卡进行直接扩增往往会出现等位基因的丢失，但是在STR分析方面，每个实验室得到的完整遗传图谱的需求越来越大。而最近推出的PowerPlex® 16 HS系统就能大大满足这种需求，针对大多数样本，包括含有大量抑制扩增反应物的案件样本，本系统都能最大可能的提供完整的遗传图谱。PowerPlex® 16 HS系统对PCR抑制物的耐受性，远远高于其他同类产品，因此对于以前扩增失败的检材，其可以得到图谱(1–3)。这些品质，使得PP16 HS成为一种有效的直接扩增的STR系统。并且，用户只需一种试剂盒就可以完成案件样本以及适于直接扩增样本的检验。

对于成功的进行直接扩增，许多参数设置都是需要特别注意的，包括样本类型、采集卡的类型、打孔仪的直径、扩增循环数和毛细管电泳的进样状态。我们最初筛查了很多种类的血卡和口腔样本卡，直径范围从0.5mm到2.0mm ，扩增循环从26到32个循环。卡片打孔直径和循环数目存在很大关联，因此用户在进行此试验时需要根据样本及卡片类型，来调节参数设置。在我们的试验中，我们采用了1.2mm直径的卡片、28个循环，结果显示这些参数适用于大部分卡片以及样本类型。另外我们测试了2种最小的卡片直径，0.5mm和0.75mm，减小打孔直径虽然可以减少卡片用量， 但是此时的静电会大大影响实验进程。而且，1.2mm的直径非常适合用于机械打孔，例如使用BSD自动打孔仪（澳大利亚），这样也就可以将整个过程整合到自动化。

虽然从我们的结果中可以看到，试验中的方法适用于大部分卡片以及样本类型，但是我们仍然建议每个实验室都要优化各自的内部参数，例如，略微增加或减小循环数目或打孔直径。另外，由于每个实验室仪器灵敏度和信号强度参数设置的不同，进样参数也是要经过优化的。在许多案例的最初实验结果中，不同类型卡片得到的图谱的平均峰高以及位点间的平衡性都有差异，因此就需要一定范围内进行进一步的优化来改善各项结果。另外，其他的一些收集卡片和收集技术，在样本沉积过程中都存在内部的差异，这些都会影响到后续的STR分析。

结论

综上，我们论证了使用PowerPlex® 16 HS 系统对口腔和血液的DNA保存卡进行直接扩增并进行STR分析的可行性及效力。这种方法最主要的优势就是，节省时间、节省成本，尤其对于数据库和父权鉴定实验室，直接扩增可以解决那里堆积的大量未检样本，同时缓解经费紧张的问题。同时，这项研究也论证了这样一种普遍用于案件分析的试剂盒，同样可以有效的应用于数据库和父权鉴定的直接扩增。这一点将有利于实验室产品的一致性，及结果的一致性。

参考文献

1. Ensenberger, M.G. and Fulmer, P.M. (2009) The PowerPlex® 16 HS System. Profiles in DNA 12(1), 9–11.
2. McLaren, R. (2007) PowerPlex® 16 versus Identifiler® Systems—Sensitivity and effects of inhibitors, #AN156, Promega Corporation.
3. AmpFlSTR® MiniFiler™ PCR Amplification Kit User Guide (2007), Applied Biosystems.