01研究背景
对乙酰氨基酚(APAP)是一种广泛使用的止痛药，但过量摄入或高危人群误用时可引起肝损伤。NEDD4-1是一种E3泛素连接酶，与许多肝脏疾病的发病机制有关; 但其在APAP诱导的肝损伤(AILI)中的作用尚不清楚。近期，吉林大学动物医学院李心慰和刘国文教授团队在“Acta Pharmaceutica Sinica B, IF 14.903”上发表文章“The E3 ubiquitin ligase NEDD4-1 protects against acetaminopheninduced liver injury by targeting VDAC1 for degradation”，揭示了NEDD4-1在AILI中的作用机制，为AILI的治疗提供了一个新的靶点。
NEDD4-1是APAP诱导肝损伤的抑制因子
维真助力：AAV载体
实验动物
雄性C57BL/6N小鼠（4-8周）
病毒产品
AAV8-TBG-NEDD4-1;
AAV8-shVDAC1
注射方式
尾静脉注射（200μL）
病毒用量
2.5×1011 VG
02结果展示
1. 肝细胞NEDD4-1缺失加重APAP诱导的肝损伤和坏死
作者在小鼠腹腔注射过量APAP，构建AILI模型，发现肝细胞NEDD4-1的表达在AILI中显著下调，且与肝损伤严重程度呈负相关。NEDD4-1缺失研究发现，肝细胞特异性NEDD4-1敲除小鼠（KO小鼠）在APAP的刺激下，产生了更严重的肝损伤，表现为血清ALT、AST、LDH和HMGB1水平显著升高。RNA-seq数据和GSEA分析表明KO小鼠中上调的基因与趋化因子、炎症小体、DNA损伤、肿瘤坏死因子信号通路和细胞死亡途径相关。作者还利用体外实验再次验证了上述结果。
图1. NEDD4-1缺失加重APAP诱导的肝损伤
2. 过表达NEDD4-1可缓解APAP诱导的肝损伤
为了进一步证实肝细胞NEDD4-1在AILI中的功能，作者使用AAV8-TBG-NEDD4-1构建肝细胞NEDD4-1过表达小鼠。APAP刺激下，NEDD4-1过表达小鼠肝脏损伤和坏死减轻，坏死面积减少，存活率提高。体外实验获得的结果与体内实验结果一致，表明肝细胞NEDD4-1过表达可以改善APAP诱导的肝损伤和坏死。进一步的研究表明，肝细胞NEDD4-1缺失加重了APAP诱导的线粒体损伤，表现出更严重的线粒体功能缺陷。但NEDD4-1过表达有效缓解了上述症状。表明NEDD4-1部分介导了APAP诱导的肝细胞线粒体损伤。
图2. NEDD4-1过表达可缓解APAP诱导的肝损伤
3. VDAC1下调减轻肝细胞NEDD4-1缺失导致的肝损伤
作者发现NEDD4-1在AILI中显著影响VDAC1蛋白的丰度，并与其成负相关。为了确定VDAC1是否参与了NEDD4-1在AILI发病过程中的调控，作者利用AAV8-shVDAC1构建了VDAC1沉默小鼠，发现APAP处理下，VDAC1沉默显著减轻小鼠的肝损伤和坏死并缓解肝脏线粒体损伤。更重要的是，VDAC1的敲除缓解了由NEDD4-1缺失引起的肝损伤增强，这些体内现象在体外实验中被进一步证实。进一步的研究表明NEDD4-1在APAP毒性中调控VDAC1的寡聚。
图3. VDAC1下调减轻NEDD4-1缺失导致的肝损伤
4. VDAC1作为NEDD4-1泛素化底物的鉴定
APAP处理后VDAC1蛋白丰度的增加但转录本含量不变，同时NEDD4-1过表达显著降低了VDAC1的蛋白质丰度，这种影响被蛋白酶体抑制剂MG132阻断，而不被溶酶体抑制剂CQ阻断，表明NEDD4-1调节VDAC1的蛋白酶体降解。泛素化实验表明，NEDD4-1显著促进了VDAC1的泛素化，但缺乏泛素连接酶活性的NEDD4-1突变体则无法实现上述功能，表明NEDD4-1催化VDAC1的泛素化依赖于其E3泛素连接酶活性，赖氨酸泛素化类型筛选结果表明，NEDD4-1促进了VDAC1的K48连接的泛素化，表明VDAC1是NEDD4-1泛素化底物。
图4. VDAC1是NEDD4-1的泛素化底物
03实验结论
本研究表明NEDD4-1通过促进VDAC1在肝细胞中的泛素化降解，缓解了AILI。这使得NEDD4-1-VDAC1通路成为治疗AILI的一个有希望的靶点，并为此类疾病及其相关病理的治疗提供了新的可能性。