概述

噬菌体T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase，T7 RNAP）于1970年首次从噬菌体T7感染的大肠杆菌细胞中分离出来，是催化RNA合成的最简单的酶之一。T7噬菌体是一种中等大小的噬菌体，其线状双螺旋DNA由39, 936 bp组成。39, 936 bp T7线性基因组的关键基因可以分为三大类，并且这三大类基因在T7感染周期的不同阶段进行表达：I类基因在感染早期表达，为噬菌体生长建立有利条件；II类是主要参与DNA复制、蛋白编码的基因；III类基因则在噬菌体生长的后期表达，主要编码结构基因。多年来，T7 RNAP已广泛应用于原核生物和真核生物中的高水平基因表达，并在生物学其他领域的应用得到扩展，例如RNA干扰、RNA编辑、合成基因电路、构建Vaccinia / T7混合系统等（如图1）。如在工业生物技术中，基于T7 RNAP的表达系统，研究者开发出谷氨酸棒杆菌MB001和大肠杆菌BL21（DE3）两个底盘菌株。由于T7 RNAP在原核环境中产生，因此T7 RNA聚合在真核环境中表达会遇到以下三种困难：i）mRNA加工，ii）加帽，iii）甲基化，和iv）真核环境中的多腺苷酸化。

图1: T7RNAP 在生物领域的多方面作用^[1]

特征

T7 RNAP 具有许多有趣的特性：

(1) 与多亚基原核和真核RNA聚合酶相比，它是一种单亚基酶^[2]，

(2) 对T7启动子具有高度特异性；但对无关的DNA甚至T3启动子不起作用^[3]，

(3) 不需要任何额外的蛋白质因子来完成完整的转录^[4]，

(4) T7 RNAP表现出有效的伸长率。它的伸长速度比大肠杆菌RNA聚合酶快约五倍，并产生非常长的转录本^[5]，

(5) 只能通过I 类和 II 类终止信号来执行转录终止，并且它独立于大肠杆菌RNA聚合酶的转录终止因子^{[6, 7]}。

这些特性增加了这种酶的优势，因此被广泛应用于在 T7 启动子的控制下表达异源基因，用于体内和体外实验。

结构与功能

T7 RNA聚合酶由883个氨基酸构成，蛋白质分子量为99 kDa，在20世纪80年代早期，已有研究者确定其一级结构。该多肽在结构上与含有单亚基DNA聚合酶和RNA聚合酶的核苷酸聚合酶家族相似，例如大肠杆菌DNA聚合酶I和逆转录酶。T7 RNAP由N-末端结构域（残基1-325）和聚合酶结构域（残基326-883）组成（见图2a）。T7 RNAP 结构的聚合酶结构域类似于右手，类似于其他核酸聚合酶结构。在催化中心具有 Mg²⁺ 离子的 T7 RNAP 的三维模型结构如图 3b 所示。聚合酶结构域可以分为表示为拇指（残基326-411），手掌（残基412–449，528–553，785–879）和手指（残基554–739，769–784）子结构域。由两个亚结构域形成的间隙是DNA模板的结合位点。针对启动子和聚合酶复合物的晶体结构的研究指出，N-末端结构域（残基1-325）的两个主要区域在序列特异性启动子结合和打开双链 DNA 中发挥着重要作用。

图2：T7 RNA聚合酶的结构^[8]

(a) T7 噬菌体基因组的主要基因产物和具有主要亚结构域的 T7RNAP 的结构域结构；(b) T7RNAP模型结构：颜色表示如下，N端域(1-325):黄色；拇指(326-411): 绿色; 手掌(412–449, 528–553, 785–879): 深蓝; 手掌插入模块 (450–527):浅蓝; 手指(554–739, 769–784): 橙色；特异性loop (740–769): 粉红色；extended foot module(838–879): 青色；C-末端结构域(880–883): 紫色。活性位点的两个金属离子显示为绿色球体。

T7 RNAP可催化从5’到3’方向的RNA合成。T7 RNAP对T7噬菌体启动子具有高度的特异性，通过识别特定的T7启动子序列并启动转录过程，利用ATP、CTP、GTP与UTP这四种天然核苷酸作为底物，通过与DNA模板碱基配对，按照碱基互补配对原则合成RNA。T7 RNAP需要DNA模板和镁离子（Mg²⁺）作为辅因子共同参与RNA的合成过程。牛血清蛋白及精胺对T7 RNAP具有促进效果。其与细菌的RNA聚合酶的差异之一，在于T7 RNA聚合酶不受抗生素立泛霉素的抑制。

图3：体外转录过程^[8]

改造

虽然T7 RNAP广泛应用于RNA的体外合成、体内蛋白表达（细菌高表达系统）等，但除了转录高效、延伸能力强等优点外，其作为体外RNA合成工具也存在一些不可忽略的缺点。T7 RNAP在合成RNA的过程中可能会产生许多的副产物，包括转录起始过程中产生的寡核苷酸、终止信号造成的中断RNA产物、依赖RNA的RNA聚合酶活性造成的3’末端延伸产物等。因而，急需优化改进T7 RNAP，使其不仅能维持高效转录，同时也能够降低RNA产物不均一的问题。现有技术中，中国授权**CN 102177236 B提供了功能改善的RNA聚合酶突变体，通过将构成野生型T7 RNAP的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺、179位的赖氨酸以及685位的缬氨酸中的至少1个位置的氨基酸残基替换为其它氨基酸，提高了这种T7 RNAP突变体的热稳定性和/或比活性。中国**申请CN 107460177 A提供了可利用化学修饰核苷酸的RNA聚合酶突变体，通过将构成野生型T7 RNAP的氨基酸序列中的632位的精氨酸替换为半胱氨酸，大大提高了T7 RNAP转录活力。美国也有一些**对野生型T7 RNAP进行了改造，例如美国**US6524828B1通过使T7 RNA聚合酶核苷酸序列的第1897位发生T→C定点突变，导致所述T7 RNAP的氨基酸序列的第633位丝氨酸变为脯氨酸，这种方法增加了RNA聚合酶突变体的稳定性。

类型

T7 RNA聚合酶可分为：常规型和耐热型。常规型T7 RNA聚合酶可在37℃对模板进行高效体外转录，而耐热型T7 RNA聚合酶可在更高的温度下进行体外转录。基于此耐热的体外转录反应特性具有以下优势：

（1）提升了GC含量较高RNA的转录效率；

（2）提升了长片段RNA的合成能力；

（3）在使用帽类似物时，提高了共转录的加帽效率；

（4）减少了dsRNA 副产物的形成，降低了合成RNA的免疫原性。

近岸蛋白转录试剂盒（货号：E131）高度特异识别T7启动子序列，能够转录不同大小的片段（如图4所示），体外转录得到的RNA完整性好（如图5所示）。并且可以在高于37℃条件下进行高效的体外转录，有效降低dsRNA含量。

图4：Qubit数据显示，Novoprotein试剂盒20μl转录体系产物磁珠纯化后产量在100-150 μg。

图5：Qsep1结果显示，体外转录得到的RNA完整性良好。

针对耐热转录体系，近岸蛋白做了不同温度下转录产量及dsRNA含量的测试。

图6：采用未修饰dsRNA标准品进行DotBlot实验及不同转录温度下dsRNA含量测定

如图6显示，转录温度越低，dsRNA含量越高，当转录温度达到50℃时，几乎检测不到dsRNA。

在考虑dsRNA含量的同时，RNA产量同样也是关键指标，近岸蛋白对在不同转录温度下的RNA产量做了测定。

如图7所示，针对4kb长度片段，转录温度提高后，产量没有很大的影响， 20ul转录体系依然可以做到130ug以上的产量。

mRNA药物研究发展得如火如荼，探索不同的技术路径和反应体系以解决当前面临的转录纯度、加帽率等问题成为研究者们最为关注的重点之一，随着整个行业的不断发展，相信成熟的mRNA技术就在不远的前方。

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参考文献

[1] Borkotoky Subhomoi,Murali Ayaluru,The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm.[J] .Int J Biol Macromol, 2018, 118: 49-56.

[2] V.L. Tunitskaya, S.N. Kochetkov, Structural-functional analysis of bacteriophage T7 RNA polymerase, Biochemistry. Biokhimiia 67 (2002) 1124-35.

[3] J.F. Klement, M.B. Moorefield, E. Jorgensen, J.E. Brown, S. Risman, W.T. McAllister, Discrimination between bacteriophage T3 and T7 promoters by the T3 and T7 RNA polymerases depends primarily upon a three base-pair region located 10 to 12 base-pairs upstream from the start site, Journal of molecular biology 215 (1990) 21-9.

[4] G.M. Cheetham, T.A. Steitz, Insights into transcription: structure and function of single-subunit DNA-dependent RNA polymerases, Current opinion in structural biology 10 (2000) 117-23.

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[6] D.L. Lyakhov, B. He, X. Zhang, F.W. Studier, J.J. Dunn, W.T. McAllister, Pausing and termination by bacteriophage T7 RNA polymerase, Journal of molecular biology 280 (1998) 201- 213.

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[8] Borkotoky Subhomoi,Kumar Meena Chetan,Bhalerao Gopalkrishna M et al. An in-silico glimpse into the pH dependent structural changes of T7 RNA polymerase: a protein with simplicity.[J] .Sci Rep, 2017, 7: 6290.

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